第五章杂合酶.ppt

抗体人源化-降低免疫应答 将CDR从一个抗体调换到另一个抗体，以便转移抗原识别专一性，降低免疫应答。 抗体的抗原化-提高免疫应答 将抗原序列插入到抗体的CDR区中，作为限制其构象，提高免疫应答的手段。 CDR----互补决定区 * 用lgG骨架呈现RGD以结合整合素，在CDR3环中插入，得到的分子对血纤维蛋白原受体具有高度的亲和力。 X射线分析其中一个三维结构，RGD区被很好的固定了。 RGD：Arg-Gly-Asp 组成的三肽，为人纤维连接蛋白与其受体的结合位点，存在于许多细胞的粘附蛋白中，可被细胞表面的受体整合素所识别。 将三肽安装到已知结构的不同蛋白质上，用于固定该蛋白质的构象，强化了与整合素受体的专一性结合。 * （3） 转移活性部位到一个新的结构上 将结构清楚地活性部位转移到结构不相关的蛋白质上，仍保留转移部位的结构和功能。 活性部位： 催化基团、?-转角、 ?-发夹等均可以取代不相关蛋白质的相关序列，实现转移。 主、客体之间没有结构同源性。 * 3．功能域交换 功能域为杂合酶的构成组件，可通过交换获得具有催化特性的酶。分子内交换和分子外交换。 关键：如何做到“无缝连接” E.G. S1家族的丝氨酸蛋白酶是由两个同源?-桶亚结构域组成，其界面形成活性部位裂隙。 疏水结构和催化三联体（Ser,Asp,His）是保守的，但围绕活性部位的表面环是可变的，它负责酶的各种底物专一性和调节性质，因此， S1的丝氨酸蛋白水解酶是通过亚结构域交换而产生新酶的很好的候选者。 * 4．功能域与结构域的融合 E.G.通过核酸结合功能域与一个辅助的水解酶的结构域融合，构建杂合体酶。 E.G. 限制酶的催化中心与一个特异性的DNA结合结构域融合，构建新的特异性限制酶。 识别结构域 DAN限制内切酶 非特异性的DNA裂解结构域 两结构域成为构建杂合酶的工具 * 5．融合蛋白 转移整个蛋白质，得到融合蛋白，既可以是双功能的，也可以是多功能的融合蛋白。 标签结构域：由核心蛋白独立折叠而成，人们很容易操纵它。指定多肽分布的结构域，机体广泛用它们来将蛋白质分配到特殊的部位。 蛋白质与特殊标签结构域的融合已经成为蛋白质工程的标准工具。 融合多肽被认为是一种将蛋白质靶向动物的方法。构建能进攻引起特殊疾病细胞的毒性融合蛋白是人们的期盼。 * E.G. 融合多肽 将信号肽序列和E.coli主要脂蛋白的部分氨基酸融合到外膜蛋白的5个跨膜片段上，从而构建了载体多肽，成功用于几种酶的显示。如?-内酰胺酶、细菌内切葡萄糖酶等 从头构建双功能酶，执行偶联反应。如?-半乳糖苷酶和半乳糖脱氢酶的杂合体、半乳糖脱氢酶和细菌荧光素酶的杂合体、苹果酸脱氢酶和柠檬酸合成酶杂合体。 对偶联反应测量偶联酶系统的稳态活力，与孤立酶相比提高了2-3倍。 * 第三节 杂合酶的制备方法 杂合酶的构建方法是DNA水平的基础操作和酶学检测方法的结合，其实质是突变（组装）和筛选。 在进化过程中，把来自不同酶分子的（亚）结构域进行组装成为一个新的单一结构域，或者把来自不同酶的本身没有活性的模块重组起来，同时在一个进化体系中筛选，就可能获得比亲本功能具有更高效率的、或者衍生出新功能的子代重组体。 * 同源扫描突变 反—内蛋白子的应用 DNA增长截短法 同源基因的改组-----SCRATCHY库 第三节 杂合酶的制备方法 * 1：同源扫描突变 同源酶PCR扩增 克隆和表达 杂合基因 Taq聚合酶扩增 不同的分裂产物混合区组合 内切核酸酶分裂 杂合酶 * 2：反—内蛋白子的应用 蛋白质合成中蛋白质的剪切是后翻译过程，涉及到前体蛋白质精确的切掉内含子，至今所描述的内蛋白子都是顺-内蛋白子。 最近人工和天然反—内蛋白子已有描述，反—内蛋白子能够融合任何两个多肽，适合产生杂合酶。 应用反—内蛋白子所产生的杂合酶在融合点一定有半胱氨酸残基，这个方法的优点是可能产生大的杂合酶库。 * 3：DNA增长截短法 DNA增长截短（incremental truncation）允许在单一实验中构建包含所有可能的缩短基因、因片段或DNA库。增长缩短是缓慢的，定向地控制DNA的消化。 应用增长缩短法，不要求任何DNA同源性和酶的结构知识，理论上两个基因的所有组合都可能产