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实用标准文案 精彩文档 各种酶活性测定方法 第一 超氧化物歧化酶SOD测定 一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（三）试剂　1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1. 酶液提取　取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应　取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3. SOD活性测定与计算　至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。 SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法 缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸； NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液 1. SOD的测定方法 加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml 试剂配制： (1) 0.05mol/L PBS：pH7.8 (2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml (3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存) (4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml (5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存) 注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管 (2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值 2.MDA的测定方法 试剂配制： （1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml （2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml 方法： 酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值 3.POD的测定方法 试剂配制： （