共振光散射法测定核酸的含量（毕业论文）.doc

第一部分文献综述 1.1共振光散射技术的原理 1.1.1光的散射 光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在人射光方向以外 的各个方向上所观察到的光现象。它源于光电磁波的电场振动而导致的分子屮电子产生的受 迫振动所形成的偶极振子。根据电磁理论，振动着的偶极振子是一个二次波源。它向各个方 向发射的电磁波就是散射波［1］。光散射与介质的不均匀性有关。除了真空之外的其它所有介 质都有一定程度的不均匀性。从而产生散射光。只是由于介质中粒子大小不同。产生不同种 类的散射。 当介质中粒子直径远大于人射光波长(人)时，产生的散射可看成是反射和折射。如果介 质中粒子直径与人射光波长相近，便产生了 Tyndall散射；如果介质中粒子很小，如人 吋，便产生以Rayleigh散射为主的分子散射L2j。分子散射是由于分子热运动造成的局部密度 涨落引起的。分子散射比Tyndall散射要弱得多。但是，即便十分纯浄的液体和气体都能产生 分子散射。根据人射光和散射光波长的不同，光散射又可以分为弹性光散射、耶弹性光散射 和准弹性光散射。其中弹性光散射乂称为经典散射或静态散射。Rayleigh散射是20人的 弹性散射，浑浊介质的Tyndall散射和透明介质的分子散射都是弹性散射。发射光波长与人射 光波长不同的Raman散射是光与分子振动交换能量的非弹性散射。而Brillouin散射是由于热 声波引起的非弹性散射。对多原子分子或基团，荧光是高能电子激发态跃迁到电子基态中的 各振动转动态产生的电子振动跃迁而形成的宽带发射谱。所以在共振光散射测定屮，荧光将 产生干扰。对于人射光频率和发射光频率仅奋微小差别的准弹性散射，是由于散射质点不停 的作Brown运动所引起的多普勒效应使散射光频率以人射光频率为中心而展宽。即动态光散 射［21。 1.1.2共振光的散射 当Rayleigh散射的波长位于或接近于分子的吸收带时，其散射程度将不再遵守Rayleigh 散射定律。而且某些波长的散射程度急剧增强，这种现象称为共振Rayleigh散射(Resonance Rayleigh Scattering, RRS) ［3］。由于RRS ?有Rayleigh散射和电子吸收光谱的双重特性，灵 敏度与选择性都有所提高，在很大程度上弥补了 Rayleigh散射信号水平低的缺陷，可以用于 稀溶液屮的分子研宄［4］。由于共振光散射理论主要是从共振Rayleigh散射增强的角度出发的， 宵吋也称共振光散射为共振Rayleigh散射。 1.2共振光散射技术的实验方法及分析定量依据 在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波 长同时扫描激发和发射单色器所得的同步光谱(即/U = 0),即为散射粒子的共振光散射光谱 ［2, 5, 6, 7］ O 由于共振光散射光谱属于同步光谱，而散射光是源于等波长人射光激发散射粒子时产生的， 因此散射粒子实际上是能发射出与激发光波长相等的新发光体，故而共振光散射信号属于同 步发光［5_71。根据同步发光方程 fSL = KCbEex(AeJEejAex+AA) 式中￡eA.是在给定激发光波长处的激发函数，是在对应的发射光波长处的 (人发射函数(L=/U+A/l)，K是与仪器条件常数有关的常数，b是液池厚度。 当AA = O时，即得共振光散射强度［5_71: !［ = ■eMEeM 即在仪器条件一定时，共振光散射强度与散射粒子的浓度成正比，据此可以用于散射粒子的 定量测定［5A 1.3共振光散射技术在核酸分析中的应用 散射光在常规光分析屮通常是作为一种干扰而被消除。1993年，Pasternack等用普通荧 光光度计建立了共振光散射技术l8j，并将其用于生物大分子的识别、组装和聚集研究。1995 年，刘绍璞等人发现离子缔合物水溶液有二级散射(SOS)和反二级散射(ASOS)现象［9’1()］，以此 建立的分析方法，使共振光散射技术的应用范围进一步扩大。近年来，共振光散射技术已被 广泛用于生物大分子的测定。目前，用于核酸分析的共振光散射探针主要有有机染料试剂、 表面活性剂、大分子散射试剂、金属离子及络合物等试剂。 1.3.1有机染料试剂 在共振光散射分析测定核酸的技术中，常用一些染料分子作为RLS探针。它是基于染料 在核酸等生物大分子上进行堆积，即生物大分子对染料起了富集作用，使其上染料浓度远大 于溶液屮游离的染料浓度，相当于聚集体的生成，使散射球体体积增人，所以以管吸收谱图 无变化，但却观测到强烈增强的RLS信号lllj。 黄承志利用meso-4(对N-三甲基氨基)卟啉(TAPP)在pH=7.48条件下与核酸作用能产生增 强的共振光散射信号，并在432 mn附近产生特征吸收峰，结果说明利用核酸对TAPP的共振 光散射增强