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实验、大肠菌群的检验 实验目的 掌握鉴别大肠菌群的方法。 掌握以最大概率数法测定大肠菌群数量的方法。 实验原理 大肠菌群指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品有否被肠道致病菌污染。 食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 实验设备 恒温培养箱:(36±1)℃ 显微镜 培养皿 试管、移液管、三角烧瓶、小倒管 天平 载玻片 实验试剂 乳糖胆盐发酵管: 20g蛋白胨、5g 猪胆盐及10g乳糖溶于1L水中,校正pH为7 .4,加25ml溴甲酚紫指示液(0.4 g/L),分装每管20 ml, 并放入一个小倒管,115℃高压灭菌20 min。 伊红美蓝琼脂平板: 10g蛋白陈、2gK2HPO4及17g琼脂溶解于1L水中,校正pH至7.1,分装于锥形瓶内,121℃高压灭菌15min。临用时加人10g乳糖并加热溶化琼脂,冷至50~55℃。加人20mL伊红溶液(20g/L)和10ML美蓝溶液(6.5g/L)摇匀,倾注平板。 乳糖发酵管: 将20 g蛋白陈和10g乳糖溶于1L水中,校正pH至7.4,加入25mL溴甲酚紫指示液(0.4g/L),按检验要求分装,并放人一个小倒管,加热至115℃高压灭菌15 min 灭菌生理盐水:0.9% 革兰氏染色液: ①结晶紫染色液: 1g结晶紫溶于20mL95%乙醇,与80mL草酸铵溶液(10g/ L)混合,摇匀。 ②革兰氏碘液: 1g碘与2g碘化钾混合后,用少量水溶解,稀释至300 mL。 ③沙黄复染液: 0.25g沙黄溶于10ml95%乙醇中,然后用90ml水稀释,混匀。 实验内容与步骤 1)检样稀释(无菌操作) ①将25mL(或g)检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶,充分振摇(固体检样用匀浆器,用8000-10000r/min的速度处理1 min)制成1:10的均匀稀释液。 ②用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内,混匀,制成1 :100的稀释液。 ③另取1mL灭菌试管,按②操作依次做10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一支1 mL灭菌试管。 2)乳糖发酵实验 接种2mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种3个稀释度,每一稀释度接种3管,置(36土1)℃温箱内培养(24士2) h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠杆菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 实验报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(或g)大肠菌群的MPN。 注: ①本表采用3个稀释度:1ML(g),0.1mL(g)和0.01 mL (g)。每稀释度3管。 ②表内所列检样量如改用10mL(g),1mL(g)和0.1mL(g)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.1ML(g), 0.01ML(g)和0.001mL(g)时,则表内数字应相应增加10倍,其余可类推。 附2:革兰氏染色法操作步骤 1、涂片:取大肠杆菌制成涂片,干燥,固定。 2、染色:用草酸铵结晶紫染色1min ,用水冲洗。 3、媒染:滴加革兰氏碘液冲去残水,并用碘液覆盖1min,用水冲去碘液。 4、乙醇脱色:斜置载玻片于一烧杯上,滴加95%乙醇,并轻轻摇动载片,至乙醇液不呈现紫色时停止(约0.5min)。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键,必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌;而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。 5、复染:蕃红染液复染1min ,水洗。 6、吸干并镜检:若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时,则需同时用已知菌进行染色作对照。 思考题 1.大肠菌群的检验分哪几个步骤?各有何作用? 2.在糖发酵试验中,若发现发酵倒管内存在极微小的气泡,这种情况可否算作产气阳性? 3.造成本实验误差的主要原因有哪些? * * 3)分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上,置(36士1)℃恒温箱内培养18一24 h。取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 4)证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1一2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置(36士1)℃恒温箱内培养(24士2) h,观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 1.斜线法 2.曲线法 3.方
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