2009分子生物学实验技术3.ppt

* 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 Hind Ⅲ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 EcoR I is from Escherichia coli. 3）限制性核酸内切酶的命名法 * 同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 4） 同裂酶和同尾酶： * GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BamHⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ * 同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A * 可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如Xba1、Nhe1以及Spe1切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即 Bfa1的酶切位点。 * 5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。 * Hind III 1ul BamH I 1ul 10X Buffer 2 ul Plasmid DNA 6-8 ul ddH2O 10-8 ul *缓冲液随不同的酶而不同。 置于37℃水浴酶切1-2hr（7h）。 质粒DNA的酶切（自提质粒） 实验步骤： * DNA酶切片段的非变性PAGE鉴定 凝胶的配制：10 ml 30％ 凝胶储存液 2.67 ml 5×TBE缓冲液（pH8.8） 2.0 ml ddH2O 5.3 ml 10％AP 70 μl 10％TEMED 60 μl * 加样：酶切后的质粒DNA溶液，加入1/5倍体积的6×上样缓冲液。上样于点样孔。 电泳：90-100 V 染色：0.5 ug/ml EB 步骤 * 分子生物学课题设计 1、思考题： 核酸凝胶电泳种类选择的依据。 2、分子医学的内容包括疾病基因的发现与克隆，生物制药、基因诊断与治疗等方面，就你感兴趣的方面设计一实验技术线路图。 * * 分子生物学实验三 BMBL 分子生物学实验三 * Contents 质粒DNA的酶切及分析 1. 重组蛋白质表达的鉴定 2. 分子生物学课题设计 3. * 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 常规PAGE 不连续PAGE SDS固相pH梯度IEF(IPG-IEF) 双向电泳 * 凝胶聚合原理 化学聚合 以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。 光聚合 核黄素B1 还原型 游离基 聚合反应 光照 O2 * 凝胶的孔径 单体和双体在凝胶中的总浓度 a+b V × 100% T＝ 双体占总浓度的百分含量，即交联度 b a＋b × 100% C＝ a，Acr的质量（g） b，Bis的质量（g） V，溶液的体积（ml） C＝6.5％-0.3T T：5％～20％ 孔径大小 * 蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系 蛋白质相对分子质量范围(kD) 适用的凝胶浓度（T%） ＜