基因打靶技术.ppt

Double Replacement HAT ,GANC 6--TG 1 3 2 靶基因组序列 1 3 tk Hprt 打靶载体1 1 Hprt 3 同源重组后序列 1 2 3 打靶载体2 1 2 3 带有精细突变的基因组序列 Tag and Exchage 1 3 2 靶基因组序列 1 neo tk 3 打靶载体1 G418 1 neo tk 3 同源重组后序列 1 2 3 打靶载体2 GANC 1 2 3 带有精细突变的基因组序列 Cre/ LoxP 系统介导的策略 1 3 2 靶基因组序列 1 2 3 带有精细突变的基因组序列 Cre介导的重组 GANC 同源重组 G418 1 neo tk 3 2 DT-A 打靶载体1 1 neo tk 3 2 同源重组后的基因组序列 3 1 Cre介导的重组 Cre介导的重组 同源重组 1 2 3 靶基因组序列 neo 1 3 Ⅲ型缺失 1 3 Ⅰ型缺失 Flox-and-delete 1 neo 2 3 tk 打靶载体 1 2 3 Ⅱ型缺失 3 2 neo 1 中靶基因组序列 Flox-and-replace 1 2 3 靶基因组序列 同源重组 Cre介导的重组 PA 2 Cre介导的重组 1 2 3 neo PA tk PA 打靶载体 1 2 3 neo PA PA 中靶基因组序列 PA 2 Ⅰ型 3 2 PA PA Ⅱ型 Flox-and-invert 1 neo 2 3 3 2 1 2 3 靶基因组序列 Cre介导的重组 Cre介导的重组 3 1 2 3 2 3 1 2 3 2 Ⅱ型 3 1 2 3 2 Ⅲ型 同源重组 1 neo 2 3 3 2 tk 打靶载体 基因打靶技术 基因打靶的产生和发展 基因打靶技术的原理 基因打靶的基本环节 基因打靶的策略 基因打靶技术的应用 基因打靶的概念 什么是基因打靶？ 基因打靶(gene targeting)技术也称为基因定点同源重组，是利用基因转移方法, 将外源DNA序列导入靶细胞后, 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同源DNA序列间的重组, 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变, 从而改变细胞遗传特性的方法。它是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。 作为一项新兴的技术，基因打靶有着其无可比拟的优点：基因打靶所适应的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞；基因打靶能把外源基因引入染色体DNA 的特定片段上；在设计合理的情况下，基因打靶可对宿主细胞染色体基因进行精细的改造；基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体DNA的复制而稳定复制。 图为：左侧为克隆兔，右侧为“代孕”母兔。 基因打靶的产生和发展 基因打靶技术最早是20世纪70年代在酵母细胞中发展起来的。对于酵母来说，大多数的外源DNA 片段通过同源重组整合到基因组内，随机插入仅占小部分，多为同源位点整合， 后来基因打靶技术逐渐应用于哺乳动物细胞，并得到进一步的发展和改进。 80年代早期，基因打靶技术开始在哺乳动物细胞中进行模式试验，以探索发生同源整合的可能性。1985 年Smithies 等首次成功的运用基因打靶技术，通过带有一条表达β-球蛋白基因的人染色体的小鼠白血病细胞，引入外援DNA 对人β-球蛋白基因进行了修饰，证实了利用同源重组对生物体的遗传信息进行定向改造的可能性。1989 年，真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠诞生。 基因打靶的产生和发展 20 世纪90年代后，基因打靶技术得到了普遍应用和长足发展。随着核移植和体细胞克隆技术的发展，人们已能对体细胞进行基因打靶，有些研究利用体细胞基因打靶成功地获得了基因缺失导致的细胞表型。 基因打靶的产生和发展 瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布将2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家马里奥-卡佩奇和奥利弗-史密西斯、英国科学家马丁-埃文斯，以表彰他们在胚胎干细胞和基因打靶研究方面所作的贡献。 基因打靶技术的原理 进行基因打靶，首先要设计和合成一个合适的打靶载体。该载体不仅含有需要插入的DNA 序列，其两端还含有与靶基因座上的序列相同的核苷酸片段，即同源重组指导序列。首先将与细胞内靶基因两端特异片断同源的DNA 分子分别连接到目的基因的两端，然后将此DNA 片段连接到带有标记基因的载体上，再将此载体用基因转移的方法导入靶细胞。通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组，使外源DNA 定点整合到靶细胞的特定基