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乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 课程要求 掌握： ①乙肝表面抗原的ELISA法定量检测方法； ②ELISA法方法学评价的方法。 熟悉： ①定量检测的酶标仪操作要领； ②各种缓冲液的配制。 了解： ELISA检测中的影响因素和注意事项。 试验目的 进行乙肝表面抗原ELISA法定量分析的方法学验证。 试验材料 1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 2 仪器及酶标板 酶标仪：Bio-Rad 680 ； 洗板机：Bio-Rad 1575； 超纯水系统：Millipore Elix ； 电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。 3 溶液配制 0.01M pH7.4的PBS缓冲液： 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 质控品： 用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。 试验方法 1 标准曲线各浓度的配制 用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng/ml。 2 测定方法 设计标准品、质控品及空白分配方案； 取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按需要重新配制； 在相应孔中加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔50ul； 37℃温育30min，洗板4次； 加入酶标抗体，生物素二抗，50 ul/孔； 37℃温育30min，洗板4次； 加入A、B液,50 ul/孔，37℃温育15分钟。 加入终止液，50 ul/孔。 3 标准曲线制作及结果计算 酶标板放入酶标仪，盖上盖子； 在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件 选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值； 输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值，打印标准曲线图和计算结果。 4 准确度（回收率）计算 按示例表1样式列表并计算回收率。 5 按示例表列表并计算精密度 。 6 检测限（LOD）计算： 取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。 注意事项 标准品和质控品配制要准确。 实验各个环节都很重要，每步操作都要认真。 讨 论 1.实验背景介绍（目的、采用的方法、检测原理、方法学验证的基本知识介绍） 2.本实验的设计及实施特点 3.实验结果分析 4.临床应用及分析 本实验报告要求 按科研论文格式 有摘要和关键词 字数不限 以WORD形式打印，元月18日前集体上交。 * * ELISA法标准曲线示意图 98.56 4.928 102.46 5.123 88.38 4.419 93.9 4.695 15.88 102.528 129.34 6.467 5 120.52 12.052 118.28 11.828 117.39 11.739 111.48 11.148 3.82 116.092 112.79 11.279 10 103.46 20.692 113.06 22.612 101.505 20.301 88.945 17.789 9.15 103.159 108.825 21.765 20 SD(%) 平均回收率RR(%) 回收率(%) 测定值(ng/ml) VEGFR2-Fc (ng/ml) 板内精密度 15.41 5.126 ±0.79 4.928 5.123 4.419 4.695 6.467 5 3.27 11.609 ±0.38 12.052 11.828 11.739 11.148 11.279 10 8.87 20.632 ±1.83 20.692 22.613 20.301 17.789 21.765 20 5 4 3 2 1 RSD(%) 测定值 VEGFR2-Fc （ng/ml） 板间精密度 16.737 4.959±0.83 4.928 4.273 5.135 5.123 4.463 5.324 4.417 3.788 4.493 4.695 4.063 4.786 6.476 5.688 6.734 5 7.97 11.423±0.91 12.052 10.709 12.584 11.828 10.479 12.455 11.739 10.459 12.558 11.148 9.928 11.869 11.278 10.090 12.173 10 12.38 19.302±2.39 20.692 18.144 20.439 22.612 19.643 22.160 20.301 16.955 17.862 7.78