ELISA的原理与应用.ppt

* 前面所讲述的凝集反应、沉淀反应以及今天要进行的补体结合反应均属于经典抗原抗体反应的范畴，这些反应的原理非常简单，就是抗原抗体的特异性结合，反应结果可以通过肉眼来直接观察凝集团块、沉淀线或者溶血现象。然而，这些经典方法的缺点是对于所检测抗原抗体的浓度要求比较高，敏感性较低，当抗原抗体量较低时，很难出现肉眼可见的上述现象。此外，用肉眼观察结果具有一定的主观性，不同的观测者可能判定的结果不一致，比如试管凝集反应凝集程度的判定。 因此，需要一种辅助性手段来提高抗原抗体反应的敏感度和标准化，免疫标记技术的发明解决了这一问题。 * 酶反应的最大特点是：高效性，一个酶分子可以结合多个底物分子，发挥酶解作用。因此，将酶连接在实验所需的抗体中，可以对抗原抗体反应有一种放大的效应，具有高灵敏度的特点 * 酶联免疫吸附试验属于免疫酶技术的一种 根据标记对象和检测对象的不同，可以分为多种类型，以其中一种来介绍这种方法的基本原理i： 首先以已知抗原包被酶标板，吸附一定时间后，洗涤未结合的可溶性抗原成分。 在吸附有抗原的酶标板中，加入待测血清，孵育一定时间，使待测血清中的特异性抗体与包被抗原充分反应、结合，之后充分洗涤未与抗原结合的游离抗体成分。 在吸附有抗原抗体复合物的酶标板中，加入针对待测抗体来源种属的酶标二抗（即若待测血清来自人，那么应加入抗人的二抗。免疫球蛋白的免疫原性可以分为同种型、同种异型和独特型，其中同种型抗原决定簇存在于CH和CL区，因此，以某一种属的IgG免疫另一种属，可以获得针对该种属所有IgG的特异性结合的抗体，由于是针对抗体的抗体，将其称之为二抗。在这个试验当中，正是利用二抗的这一特点，用于最后的酶反应显色，因为这样就可以同一种属的同一类抗体制备一个酶标二抗，这一二抗可以用于来自该种属所有同类抗体的检测。 酶标二抗吸附一定时间后，充分洗涤，去除未结合成分。 加入标记酶的相应底物，孵育一定时间后显色。 * 酶联免疫吸附试验属于免疫酶技术的一种 根据标记对象和检测对象的不同，可以分为多种类型，以其中一种来介绍这种方法的基本原理i： 首先以已知抗原包被酶标板，吸附一定时间后，洗涤未结合的可溶性抗原成分。 在吸附有抗原的酶标板中，加入待测血清，孵育一定时间，使待测血清中的特异性抗体与包被抗原充分反应、结合，之后充分洗涤未与抗原结合的游离抗体成分。 在吸附有抗原抗体复合物的酶标板中，加入针对待测抗体来源种属的酶标二抗（即若待测血清来自人，那么应加入抗人的二抗。免疫球蛋白的免疫原性可以分为同种型、同种异型和独特型，其中同种型抗原决定簇存在于CH和CL区，因此，以某一种属的IgG免疫另一种属，可以获得针对该种属所有IgG的特异性结合的抗体，由于是针对抗体的抗体，将其称之为二抗。在这个试验当中，正是利用二抗的这一特点，用于最后的酶反应显色，因为这样就可以同一种属的同一类抗体制备一个酶标二抗，这一二抗可以用于来自该种属所有同类抗体的检测。 酶标二抗吸附一定时间后，充分洗涤，去除未结合成分。 加入标记酶的相应底物，孵育一定时间后显色。 3.2.4　结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。 3.2.5 　结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。 试剂准备 C 酶的底物 3.3 　酶的底物 3.3.1 　HRP的底物 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 E TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。 AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长