水解酶及氧化还原酶组织化学原理及方法.ppt

水解酶及氧化还原酶组织化学 原理及方法 水解酶 hydrolases 指催化底物发生水解反应的酶类 例如:磷酸酶类、酯酶类等 AB＋H2O AH＋BOH 磷酸酶类 磷酸酶类是水解磷酸化合物的酶的总称 水解磷酸酯键，释放磷酸离子，为重金属捕获而产生沉淀；或释放萘酚而为重氮盐耦联 而显色。 碱性磷酸酶：在pH9.2-9.4表现为最大活性 酸性磷酸酶：在pH5.0显示最大活性 显示法： 金属沉淀法 偶氮耦联法 碱性磷酸酶alkaline phosphatase ,AKP、ALP 在碱性范围，催化各种醇和酚的磷酸酯水解。 磷酸和R能用组化方法捕获。 钙钴法：捕获磷酸 偶氮耦联法：当R为萘酚衍生物时，捕获R 二者最终均形成有色沉淀，可作定位观察。 激活：金属离子—Mg2+ 、Mn 2+ 、Zn 2+ 、Co 2+ 抑制：Tetramisol(四咪唑)、各种醇类、L-半胱氨酸 钙钴法（金属沉淀技术 ）Gomori-Takamatus法 原理：把游离的磷酸变为盐的形式从而产生沉淀 β-甘油磷酸钠（底物）─→磷酸离子 磷酸离子+Ca2+ ─→磷酸钙（不可见） 磷酸钙+Co2+ ─→磷酸钴（不可见） 磷酸钴+S2- ─→硫化钴（不溶，可见） 条件：pH9.4 作用液： 2%巴比妥钠 3%β-甘油磷酸钠 2%无水氯化钙 2% MgSO4.7H2O 步骤： 新鲜恒冷箱切片，8μ 不固定直接进作用液 FCa（氯化钙Formalin）固定5-2h，4℃，固定后蒸馏水洗 作用液10-60’，37℃（视组织而定） 流水5’ 2%硝酸钴5’ 蒸馏水洗 1-2%硫化铵1’（ *硫化铵需新鲜配制） 蒸馏水洗 甘油明胶封 结果： 黑色的颗粒状沉淀 对照： 去底物（以双蒸水替代β-甘油磷酸钠），结果阴性 进作用液前用抑制剂抑制酶或将切片置沸水中使酶失活 注意：组织内含铁血黄素与钙盐形成棕黑色沉淀，应鉴别（铁反应） AKP主要存在于 物质交换活跃处：肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、肝毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部的内皮 内质网、高尔基复合体、吞饮小泡肠上皮的溶酶体、中性粒细胞的中性颗粒，平滑肌细胞膜 是细胞膜的标志酶之一 骨肉瘤内有丰富的AKP 偶氮耦联法 原理：磷酸萘酯经酶水解放出萘酚，立刻为重氮盐捕获而成为有色不溶的偶氮染料。 α-萘酚磷酸钠 α-萘酚 α-萘酚 重氮盐 （固蓝RR） 偶氮染料 Lojga改良Burstone偶氮耦联法 作用液 萘酚AS-SI磷酸钠 DMSO(二甲基亚砜) 六偶氮对品红 A液：盐酸对品红400mg，蒸馏水8ml，浓盐酸(36%)2ml 混合溶解过滤 B液：4％亚硝酸钠液 临用前A、B液等量混合 Tris-HCl缓冲液（pH 8.2~9.2） 步骤： 小块组织用液氮骤冷，恒冷箱切片 固定FCa 5分钟，4℃，固定后蒸馏水洗 不固定 作用液5-60’，37℃或室温 蒸馏水洗 4%甲醛固定15’-2h，室温 自来水洗，蒸馏水洗 1%甲基绿（氯仿洗过）5-10分钟，蒸馏水洗 （1）甘油明胶封 （2）丙酮-丙酮甲苯-甲苯-DPX封 结果： 酶活动处出现红色无定形的沉淀，核呈蓝绿色，对比明显 *重氮盐也可用固蓝B盐, 这种酶的反应活性部为紫黑色，核的对比染色应改用核固红或中性红。 钙钴法和偶氮耦联法比较 钙钴法操作简单，但会出现假阳性现象 偶氮耦联法的保温时间短，方法比较灵敏；在正常组织中无萘酚，不会出现假阳性，故不需对照切片；反应产物为偶氮染料，较磷酸钙更难溶解，定位好，不易扩散，图象清晰，并可控制反应深度 酸性磷酸酶（ACP） ACP是在酸性范围里水解磷酸单酯，游离出磷酸的酶 最适pH为4.5-5.5 Gomori 铅法 作用原理同AKP。因磷酸钙在酸性pH溶解，故用硝酸铅作为捕获剂，再用硫化氢直接把磷酸铅转变为硫化铅，最后形成棕黑色硫化铅沉淀。 激活剂：Mn2＋ 抑制剂：氟化钠、磷酸根离子 对照：去底物；抑制酶 作用液 巴比妥醋酸缓冲液（PH5.0）　　20ml 3%β-甘油磷酸钠　　　　　　　2ml 硝酸铅　　　　　　　　　　　 24mg 用巴比妥醋酸缓冲液溶解硝酸铅，然后再加入3%β-甘油磷酸钠，彻底混合后过滤，再测定其PH值，如不足或高于，都应调校至5.0。 步骤 恒冷箱冷冻切片，附贴于硅化载玻片上，电吹风吹干30分钟后，用纯丙酮固定5-10分钟。 蒸馏水轻洗。 将切片于作用液中孵育30-120分钟（37℃）。