HEK293T细胞培养03资料.ppt

细胞污染问题与解决方案 细胞的细菌污染 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以。革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、假单胞菌等。其中又以白色葡萄球菌较常见。 细菌污染后，会很快出现培养液变混浊，pH改变。也有少数培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。 细胞污染问题与解决方案 细胞的细菌污染检测 16S RNA PCR法 细胞污染问题与解决方案 常见的细菌污染 白色链球菌污染以及革兰氏染色图片 细胞污染问题与解决方案 细胞的真菌污染 梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。 真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。 细胞污染问题与解决方案 细胞的真菌污染检测 镜检有丝状物 细胞污染问题与解决方案 常见的真菌污染 真菌污染 霉菌污染 细胞污染问题与解决方案 细胞的支原体污染 细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题 细胞被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。 细胞污染问题与解决方案 细胞的支原体污染检测 试剂盒检测法： 目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测 间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性 细胞污染问题与解决方案 常见的支原体污染 支原体污染的电镜下图片 细胞污染问题与解决方案 细胞污染的解决方法 控制环境污染；严格实验操作 原则上弃掉 加抗生素 污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。 细胞污染问题与解决方案 细胞污染的解决方法 加抗生素 细胞污染问题与解决方案 何时需更换细胞液 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可 细胞污染问题与解决方案 何时需更换细胞液 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可 细胞污染问题与解决方案 可否使用与原先培养条件不同之培养基 不能，每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活 细胞污染问题与解决方案 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 细胞间的操作注意事项 未经许可，任何人不得进入细胞间。 不得在细胞间内做任何与试验无关之事。 不得携带任何与实验无关或可能导致污染的物品进入细胞间。 必须随时保持细胞间的整洁、卫生，及时清理杂物、垃圾。 所有设备、物品，使用后必须及时归位。 进入细胞间必须更换细胞间专用拖鞋与工作服。不得将细胞间专用拖鞋与工作服传出细胞间外。 进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关闭状态。 LOGO 细胞间的操作注意事项 操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-20分钟。 试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%酒精消毒双手。 实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、关闭风机。 凡是带入操净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置显微镜前，用75%酒精擦拭消毒载物台 使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。 每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入放入培养箱中继续培养。 LOGO 细胞间的操作注意事项 每一个人操作结束后，必须及时清理操净工作台内的物品，不得在工作台内留置或堆积杂物。 清理操净工作台后，用75%酒精擦拭消毒操净工作台面。 每一个操作结束后，必须及使用84消毒液消毒管道，并清理废液瓶，及时弃去废液。 操作结束后，确认倒置显微镜电源关闭。 操作结束后，确认二氧化碳培养箱的两道门均处于关闭状态。 离开细胞间前，确认空调已关闭（夏季高温季节除外）。 每日最后一人离开细胞间前，打开紫外灯消毒。 进入或离开细胞间时，注意观察二氧化碳钢瓶上的压力表压力是否正常（减压阀出气口的压力应在0.06-0.08Mpa之间）。 注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。 定期打扫细胞间：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、操净工作台等，然后用3‰苏尔或者新洁尔灭或者5%过氧乙酸擦拭 * * * * * * * * * * L