HPLC实验步骤和方法开发资料.ppt

液相色谱的应用以及方法开发 提纲： 一.HPLC的广泛应用 二.方法开发过程 一）选择HPLC检测器 二）分配色谱及选择流动相 三）方法开发的具体步骤 四）梯度洗脱方法 HPLC的应用领域 在医药研究中分析应用 药物分析有USP、BP、CP等标准 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。 在兽药研究中分析应用 二.方法开发的过程 第一步干什么? 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA--- 仪器制造商的文献，如Dionex,Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离(制备)时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成? 使用文献方法注意点 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 一）选择HPLC检测器 对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距 用于HPLC的检测器 没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（选择型） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型） 整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型） 理想的HPLC检测器 高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性 灵敏度：信噪比 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性 选择液相色谱的检测器 要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求 选择液相色谱的检测器 吸光度（ UV/Vis）检测原理 原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速不敏感 2）可用于梯度洗脱 3） 灵敏度较高，ng级检测 缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质 吸光度（ UV/Vis）检测的应用 背景吸收的影响 光电二极管矩阵（Photo Diode Array） 荧光（Fluorescence）检测原理 原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子达到激发态，当其返回到基态时发射光的现象即荧光 优点：荧光检测器灵敏度高, pg级检测 缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生 荧光检测器原理 荧光检测器的应用 环境中的污染物 多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、饮料 食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨基酸 生物技术及制药 示差折光（Refractive Index）检测 示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初） 通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 － 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真