第二章动物细胞工程.pptVIP

1. 原代培养 原代培养是从机体取得材料开始，在培养瓶内培养至第一次传代前的这一过程。主要方法有组织块培养、酶解培养法。 采用助融剂聚乙二醇 （ PEG）和高Ca2+、高pH相结合。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：可促使细胞凝结；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。 一、历史回顾 1932年 Spemann提出设想：分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育？ 1952年 Briggs和King在两栖动物证实了Spemann提出设想 1955年 他们获得了一只蝌蚪的细胞创造了与原版完全一样的复制品。 二、细胞核移植 将早期胚胎、胎儿或成体动物的细胞核移植到去核的卵母细胞中，重新组成重构胚并使之发育成成体动物的过程。 去核的方法 （1）直接穿刺法。 （2）盲吸法。 （3）半卵法。 （4）用DNA荧光染料对卵母细胞染色，然后在荧 光监视下去核。 （5）功能性去核，将卵母细胞置于用荧光燃料配 置的溶液中,用紫外线照射使核失去功能。 A 显微注射针刺入卵母细胞前 B开始吸取第一极体 C 极体已被吸入注射针 D 去除极体后的卵母细胞 E 注射供体细胞 F 供体细胞已被注入透明带下 电融合 重构卵激活 核移植过程中的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。激活的方式有电激活、化学激活和注射精子因子激活。 重构胚的培养 重构胚移入受体之前的培养方法有体外培养和体内培养两种方法。体外培养法相对要简单方便的多。 重构胚的遗传学鉴定 利用种属特异性探针（人类X、Y探针）对卵裂球细胞进行荧光原位杂交。 三、核移植分类 根据核供体细胞来源的不同： （1） 胚胎细胞的核移植 （2） 体细胞的核移植 根据供体细胞与受体细胞是否来源于同一种动物： （1）同种核移植 （2）异种核移植 胚胎细胞核移植技术 胚胎细胞核移植 (embryo cell unclear transplantation)：将一个早期胚胎的细胞核移植到去核的卵母细胞中，构建新合子的生物技术，通常将提供细胞核的细胞称为供体，接受细胞核的卵母细胞称为受体。 核移植所用的供体细胞均为囊胚阶段以前的胚胎细胞。当时人们普遍认为，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后则随着分化而逐渐丧失其全能性。 胚胎细胞核移植 1981年，瑞士日内瓦大学的伊尔门泽、美国杰克逊实验室，首次对小鼠卵进行核移植获得成功。 此后，胚胎细胞的核移植在多种动物上获得了克隆后代，如绵羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),猪(Prather等,1989),山羊(张勇等,1991)等。 直到1997年才由 Meng et al成功地克隆出两只猴,这是灵长类动物的首次被克隆。 胚胎细胞核移植存在的问题 对于濒危动物来说，由于种群数量有限，卵母细胞较难获得；而在人类，由于伦理等原因，卵母细胞的获得同样困难。核供体、核受体胚胎来源困难。限制了核移植技术为人类服务的初衷。 解决办法 （1） 体细胞核移植—— 解决供核困难 （2） 异种胚胎核移植——解决核受体胚胎来源困难 问 题 当时人们普遍认为，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后则随着分化而逐渐丧失其全能性。哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化，但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？ 核重编程 核重编程的过程就是使在体细胞中被关闭，而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程。 重编程有三种可能的结果： （1）供核基因组完全没有进行重编程，重构胚很快死亡； （2）部分重编程，重构胚在不同的发育阶段死亡； （3）完全重编程，产生正常的克隆动物 。 体细胞核移植技术—— 动物克隆技术的里程碑 体细胞核移植技术(somatic cell unclear transplantation) 将分化程度较高的体细胞移植入去核的卵母细胞中构建新合子的生