毕业论文-小鼠microRNA-125b过表达载体构建.doc

必威体育精装版精品文档，知识共享！ 小鼠microRNA-125b过表达载体构建 目 录 TOC \o 1-3 \h \z \u HYPERLINK \l _Toc420006237 摘要 PAGEREF _Toc420006237 \h 1 HYPERLINK \l _Toc420006238 Abstract 3 HYPERLINK \l _Toc420006239 1 前言 4 HYPERLINK \l _Toc420006240 2 材料与方法 5 HYPERLINK \l _Toc420006241 2.1 材料 5 HYPERLINK \l _Toc420006242 2.2主要试剂与仪器 5 HYPERLINK \l _Toc420006243 2.2.1主要试剂 5 HYPERLINK \l _Toc420006244 2.2.2主要仪器 5 HYPERLINK \l _Toc420006245 2.3 方法 6 HYPERLINK \l _Toc420006246 2.3.1质粒提取 6 HYPERLINK \l _Toc420006247 2.3.2鼠尾基因组DNA提取 6 HYPERLINK \l _Toc420006248 2.3.3 PCR引物设计与合成 7 HYPERLINK \l _Toc420006249 2.3.4 PCR扩增 7 HYPERLINK \l _Toc420006250 2.3.5琼脂糖凝胶电泳检测 7 HYPERLINK \l _Toc420006251 2.3.6 DNA产物纯化及回收 8 HYPERLINK \l _Toc420006252 2.3.7酶切及鉴定 8 HYPERLINK \l _Toc420006253 2.3.8载体构建 9 HYPERLINK \l _Toc420006254 3 结果与分析 9 HYPERLINK \l _Toc420006255 4 讨论 11 HYPERLINK \l _Toc420006256 5 结论 11 HYPERLINK \l _Toc420006257 6 参考文献 12 HYPERLINK \l _Toc420006257 致谢 14 必威体育精装版精品文档，知识共享！ 摘 要 NPC1是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释。研究发现miRNA对tau蛋白的调控和神经元存活至关重要，通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶来调节tau蛋白磷酸化水平。Tau?蛋白过度磷酸化损伤神经细胞功能和结构，如过度磷酸化使Tau?蛋白结合微管能力降低[1]，Tau?蛋白在神经元内聚积导致神经元轴突转运障碍[2]、乙酰胆碱释放减少[3]、蛋白酶体活性抑制[4-7]，这些功能和结构的改变可能导致神经元呈慢性进行性变性构建miR-125b表达载体，从tau蛋白磷酸化调控的研究入手，系统地研究参与tau蛋白磷酸化调控的miR-125b的靶基因，阐释其中的分子作用机制，为tau蛋白异常病变引起的神经退行性疾病的研究与防治提供新的思路。 本实验目的：构建小鼠microRNA-125b（miR-125b）过表达载体。 方法：参考小鼠miR-125b前体序列的PCR扩增引物，重新设计限制性内切酶位点为Nhe I和EcoR I，PCR扩增，然后将目的片段和pcDNA3.1-EGFP质粒进行双酶切鉴定，使用T4 DNA连接酶进行连接，转化DH5α感受态细胞，挑取重组阳性克隆，对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。 结果：菌液PCR筛选鉴定出正确的miR-125b过表达载体，测序分析证实克隆的基因序列正确。 结论：成功构建小鼠miR-125b的真核表达载体，为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。 关键词：microRNA-125b；pcDNA3.1-EGFP；过表达载体 Construction of microRNA-125b overexpression vector in mouse Abstract Objective To construct the microRNA-125b(miR-125b) overexpression vector in mouse. Methods PCR amplification primers of miR-125b precursor sequence referred to article, we redesigned restriction enzymes for