第四章 抗体的人工制备.ppt

[目的与要求] 1、掌握单克隆抗体和多克隆抗体的概念、制备原理及其制备的具体过程 。 2、了解基因工程抗体与催化抗体的概念及意义 。 [难点与重点] 重点与难点：单克隆抗体和多克隆抗体的概念、制备原理及其制备的具体过程 。 目前较好的解决办法是能研制基因工程抗体，以代替鼠源单克隆抗体用于临床。基因工程抗体兴起于80年代早期，是利用DNA重组技术，在分子水平对抗体基因进行切割、拼接或修饰，或人工合成后导入受体细胞表达，从而产生的新型抗体，也称为第三代抗体。 研究成功的基因工程抗体有：嵌合抗体、重构抗体、小分子抗体等。 一、概念 利用基因工程技术制备的抗体分子 。 按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构(如Fc片段)，从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷(如鼠源单克隆抗体在人体内使用会引起抗体产生而降低其效果，Fc片段的无效性和副作用)，更具有广阔的应用前景。 二、特点 嵌合抗体(chimeric antibody)是指在同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体，又称杂种抗体。 重构抗体 ：将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因中，再将此DNA片段与人Ig恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗体。 * 第四章 抗体的人工制备 章节安排 第一节 多克隆抗体 第二节 单克隆抗体 第三节 基因工程抗体 第四节 催化抗体 为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。 目前，根据制备的原理和方法可分为四类： 多克隆抗体  单克隆抗体  基因工程抗体 催化抗体 　　大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。 　　多克隆抗体：多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 第1节 多克隆抗体 一、概念 二、多克隆抗体制备的基本过程 试血测定抗体效价 血清的分离与保存 多抗的纯化与标记 多抗的亲和层析 抗体的保存 缓冲体系 防腐剂 稳定剂 浓度 存储时间 （多头加样枪）排枪 ELISA板 96孔细胞培养板 第二节 单克隆抗体 一、单克隆抗体的概念 1、概念：由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。 2、特点：抗体的重链、轻链及其V区独特型的特异性、亲和力、生物学性状及分子结构均完全相同。 这种杂交瘤细胞：既具有骨髓瘤细胞能大量无限生长繁殖的特性，又具有抗体形成细胞合成和分泌抗体的能力。 10:1 杂交瘤细胞一般采用HAT选择培养基进行初筛，培养基中加入次黄嘌呤（Hypoxanthine，H）、氨基喋呤（Aminoopterin，A）及胸腺嘧啶（Thymidine，T），利用A阻断核酸的主要生物合成途径。代谢缺陷型细胞株缺失旁路DNA合成所需的酶——次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶（HGPRT），不能利用外源性的核苷酸前体，如H和T，丧失DNA合成的旁路途径；只能通过以叶酸为媒介，由氨基酸和其它小分子化合物合成核苷酸进行DNA合成。一旦叶酸衍生物的合成被HAT培养液中的A阻断，这些细胞因为失去DNA合成的主通道，又无能力从旁路合成DNA而死亡。正常细胞在H和T存在的情况下，可利用旁路途径继续合成核酸。小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞株为代谢缺陷型细胞株，融合后在HAT培养基中不能生长，而融合细胞由于含有来自正常细胞的HGPRT酶，在HAT培养基中可以存活。 单克隆抗体的制备过程： 在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。 在用HAT选择培养1～2d内，将有大量瘤细胞死亡，3～4d后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10d后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3d换一半培养液。 单克隆抗体的制备过程： （1）天然抗原的制备； （2）免疫动物的确定、免疫剂量及免疫次数的确定； （3）骨髓瘤细胞的准备； （4）小鼠采血测定抗体效价； （5）小鼠脾细胞的制备及饲养细胞的制备