抗肿瘤药物筛选方法.pptVIP

法尼基转移酶（Ras）抑制剂筛选 Ras蛋白是调节细胞生长和增殖的信号通路的重要元件, 是控制外来分子信号的分子开关。Ras蛋白以GDP结合和GTP结合两种形式存在。 原理： (pull down assay) 活化形式的GTP-Ras与下游的效应蛋白 Raf（Raf有Ras-binding domain，Raf- RBD）结合。 Raf-RBD-GST融合蛋白固化谷胱甘肽亲 和树脂 （GSH），与含有GTP-Ras的样 品孵育，Raf-RBD与GTP-Ras充分结 合，洗脱后，经免疫印迹检测Ras的表 达量。 GSH resin GST Raf-RBD GTP-Ras Anti-Ras antibody 丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选 丝裂原活化蛋白激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，将细胞外刺激信号传导到细胞核内，并引起细胞的生物学反应，如增殖、凋亡、分化等。主要有三条信号通路：ERK （Extracellular signal regulated kinase），JNK (c-Jun N-terminal kinase)和p38。 原理：生物大分子相互作用分析（Biacore） Biacore系统以无标记的检测方式来实时监 测分子间的相互作用， 可观察两种分子结 合的特异性，能检测到两种分子的结合能 力，了解生物分子的结合过程共有多少个 协同者和参与者。 实验方法：先将多种生物分子（MAPK酶等）固定 在传感器芯片表面，将与之相互作用 的分子溶于溶液流过芯片表面。检测 器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表 面的分子结合、解离整个过程的变化 小 结 动物水平筛选 　　腹水瘤，S-180肉瘤，人癌裸鼠移植模型 细胞水平筛选 　 抗肿瘤增殖（MTT法， SRB法，排染试验) 　　分化诱导剂（NBT还原法） 　　调亡诱导剂（Hoeschst，ＤＮＡ梯带，Annexin-V/PI） 　　血管生成抑制剂（人血管内皮细胞，鸡胚尿囊，斑马鱼） 　　耐药性逆转剂（Ｐ－ｇｐ抑制剂） 肿瘤侵袭和转移抑制剂（Transwell） 自噬诱导剂（TEM， LC3， MDC） 酶水平筛选 　 ＤＮＡ拓扑异构酶抑制剂筛选 端粒酶酶抑制剂筛选 VEGFR 酪氨酸蛋白激酶酶抑制剂筛选(ELISA) 组蛋白去乙酰酶抑制剂筛选 基质金属蛋白酶抑制剂筛选(FRET) 法基尼转移酶抑制剂筛选(Pull down assay) 丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选(Biacore) 展望 　 抗肿瘤药物正从传统的细胞毒性药物,向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。 　 　 新技术的发展特别是微阵列技术、生物芯片技术、蛋白组技术、生物信息技术、组合化学等的应用将使新靶点的识别、新的活性化合物的筛选走向微量化、自动化、简单化。 6. 抗肿瘤侵袭和迁移实验 转移是恶性肿瘤的重要特征 肿瘤的迁移是一个多阶段的复杂过程，Liotta等提出肿瘤侵袭和转移的三步学说，即粘附、降解和移动。粘附是肿瘤细胞侵袭的起始，肿瘤细胞通过表面特定受体与基底膜的层粘连蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原等相粘连，然后在蛋白水解酶和相关因子的作用下，侵袭基底膜，降解细胞外基质肿瘤细胞一旦突破基底膜，逃避免疫监视，即在基质内较快侵袭性生长并发生转移。 阻断其中任何一个过程，都可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭 １）粘附实验 　原理：将Matrigel铺在96孔板上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构，可以有效地在体外模拟肿瘤细胞的粘附过程。 方法：将Matrigel包被96孔板，过夜，将药物处理后的细胞接种在96孔板，1h后，弃去未粘附的细胞，加入MTT培养，测定吸光度。 结果： 细胞粘附 抑制率（%） = （ OD对照-OD实验） OD对照 X 100% 2）细胞划痕实验（运动能力检测） 方法：细胞按30000个/孔密度接种于6孔板，待细胞贴壁生长到90%融合度，用20 uL移液器枪头在每