多克隆抗体的制备.ppt

半抗原性免疫原的制备 载体选择： （1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。 （2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。 连接方法： 物理法：是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等； 化学法：是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。 根据化学基团不同，连接方法主要有以下几类： 带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。 带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-羧甲基、羟胺法等方法将之转变为带有羧基的 半抗原衍生物后才能与载体连接。 带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。 谢 谢 请提出您的宝贵意见！ Ab1 Ab3 Ab4 单克隆抗体 抗原 Ab1 抗血清 Ab1 Ab2 Ab3 Ab4 Ab2 Ab3 Ab4 普通抗血清（多克隆抗体） 脾 B细胞 骨髓瘤小鼠取腹水 骨髓瘤细胞 HAT培养，稀释 单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图 杂交瘤细胞 + PEG, 融合 Ab2 盐析法沉淀抗原的机理 凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理 亲和层析的作用机理 颈动脉分离图 ELISA技术路线 多克隆抗体的制备及抗体活性测定 主要内容 多克隆抗体制备的基本原理 多克隆抗体制备的操作步骤 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断 原 理 1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中，如无发生突变其基因是完全相同的。 2、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。 3、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。 抗体发展历史 多克隆抗体制备流程 免疫原的制备 免疫动物 免疫血清的收集 免疫血清的鉴定 免疫血清的保存 免疫原（immunogen）： 指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）. 免疫原种类： 天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。 免疫原的制备 细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）。 可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。 细胞破碎 反复冻融法 超声破碎法 自溶法 酶处理法 表面活性剂处理法 超速离心分离： 是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密 度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只 适宜少数大分子物质的分离。 选择性沉淀： 选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如： 核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白； 8%～12%PEG6000可沉淀IgG。 粗分离 超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。