分生物学技术(中国药科大学).docVIP

分子生物学技术 克隆（clone） 定义：广义上是指利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组的后代的过程。在生物学上，是指选择性地复制出一段DNA序列（分子克隆）、细胞（细胞克隆）或是个体（个体克隆）。克隆技术又称为“生物放大技术”。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 命名方式：主要依据来源来定，一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)，最后的序号用罗马字符ⅠⅡⅢ表示第几个发现的。如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。 限制与修饰系统（Restriction-modification system，R-M system） 限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。 限制性内切酶特异性识别位点 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构（palindromes），切割位点在 DNA 两条链相对称的位置；识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基。 不同的限制酶切割DNA位点的效率（frequency）不一样。切割DNA 的两条链，则产生平末端或粘性末端。 ？？同裂酶（isoschizomers）：识别位点相同，切割位点不一样。 同尾酶（isocaudarner）：即能切割产生相同末端的限制性内切酶 载体（vector ）：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。（目的基因无复制原点，不能自我复制）特点：自我复制、运载工具、多克隆位点、标记基因、安全性等。 三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。 质粒载体pBR322 抗生素抗性基因：氨苄西林抗性和四环素抗性 DNA复制起点：ori 限制性酶切位点：EcoR1，Pst1，BamH1 克隆过程： pBR322质粒和目的基因 使用Pst1对质粒和目的基因酶切 产生粘性末端（sticky ends） DNA连接酶连接成环状基因 导入细菌 四环素抗性氨苄西林敏感筛选 （外源DNA破坏了氨苄西林抗性基因） 影印接种法(replica plating) 具体过程是：将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上，等其长好后作为母平板（每平板上的菌落控制在50～300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具）；然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下；再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下，经培养后，选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较影印平板与母平板上菌落生长情况，即可从相应位置的母平板上选出待测的突变型菌落。影印法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的实验，目前已广泛应用于营养缺陷型的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。 改进质粒PUC系列18/19，无四环素抗性基因，含有lac Z’基因 LacZ基因（β-半乳糖苷酶基因） 包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。广泛用于基因表达调控研究中的一种基因，LacZ基因编码的beta一半乳糖普酶（简称beta-gal)是由4个亚基组成的四聚休，可催化乳糖的水解。Beta-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察。LacZ基因是基因工程实验中的一个常用标记基因，比如常用于转化菌株筛选，β-半乳糖甘酶显色反应选择法，即蓝白筛选。例如，基因克隆中常用的质粒载体PUC 19及噬菌体载体M13系列均带有LacZ基因。 蓝白斑筛选 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-