生物分离工程-第二章-细胞破碎.ppt

（一）、重力沉淀 1、重力沉淀的定义 2、重力沉淀的理论 3、提高重力沉降的途径 （二）、离心沉淀 1、离心沉淀的定义 2、离心沉淀的理论 3、离心分离方法 4、离心分离设备 离心方法新进展具体表现在哪几个方面？ 1.固定角转子垂直管离心法的进展 使用垂直管转子的成功之例是1980年由B. H. Chung等提高的血清脂蛋r白分离的SVs方法(即Single Vertical Spin法,一单次垂直管离心法)，它使对临床诊断意义很大的这一分离在实用上成为可能.传统的血清脂蛋白分离用“顺序浮选法”(即SF法)，一次分离需时3天，用去驱动寿命1亿转以上。现用垂直管转子作SVS方法，不连续NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5万一6.5万转/分，0.75-2.5 i)时，一次分离成功。 3.短液柱离心法(Short-Column method) 由美国的0. M. Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平转子中人为地使用不加满的离心管来降低液柱高。此法不仅降低液柱高以减少离心时间，更重要的是使处千液面的样品受到更大的离心力从而进一步缩短了离心时间，在不减少样品量和样品浓度的条件下，可把离心时间缩短为常规满管离心时的一半或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它们在不加满离心时也不会变形。 4.细绝(或细菌)的离心洗脱(Flutriator) 技术 这是美国Beckman公司近年发展的一种低速连续洗脱技术，特别适用于培养液的连续收集。使用的是带小容量连续离心池的JE-6B转子.其洗脱原理不是在一般转子中的沉降，而是被分离物在离心中的“浮选”。用4. 2ml的离心池可在1小时内从100-1 000m!的原液中回收10-10，个细胞。 2.超速连续离心法 超速连续离心转子是由美国Beckman公司开发的，最适用于病毒的纯化，从大量的组织匀浆中分离亚细胞组织、培养液中细菌的收集，以及污水研究。 （三）、过滤 1、过滤的定义 2、过滤的受力分析 3、提高过滤速度的途径 二、细胞破碎与胞内物释放 1、概述 2、细胞破碎技术的分类 3、常用破碎方法的介绍 1、概述 （1）细胞结构 （2）细胞膜的组成 （3）影响产物释放的因素 2、细胞破碎技术的分类 细胞破碎的目的 是释放出细胞内含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。 3、常用细胞破碎方法介绍 缺点： 这种方法较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。 缺点： 设备是珠后机，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。存在的问题：操作参数多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30％左右。 缺点： 超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。 （5）化学渗透法 有些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 缺点： 时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。  （6）酶溶法 就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶，β-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 缺点： 易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。 （7）细胞破碎技术研究发展方向 1、多种破碎方法相结合 2、与上游过程相结合 （1）克隆噬菌体溶解基因 （2）耐高温产品的基因表达 3、与下游过程相结合 小结： 1、细胞分离 重力沉淀、离心沉淀、过滤 2、细胞破碎 机械破碎法与非机械破碎法，不同方法的区别 3、细胞破碎的发展方向。 作业： 1、常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。 2、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何特点？ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （3）影响产物释放的环境因素 在复杂培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难； 对数生长期的细胞会表现得更加脆弱。 从连续培养过程中获得的、具有较高比生长速率的念珠菌的