细胞生物学研究思路——基础医学 2016-9-16.pptVIP

* * * * * * * * 基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术 PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。 在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。 基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术 PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。 基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术 CRISPR-Cas系统介导基因修饰 基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术 CRISPR-Cas系统介导基因修饰——dual-RNA 基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术 CRISPR-Cas系统介导基因修饰——sg-RNA Cas9 sg-RNA 基因突变、敲除与沉默技术——CRISPR-Cas技术 CRISPR-Cas系统介导基因修饰——cr-RNA * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 新的问题或未解决的问题 所有技术为我所用 研究思路——基于新现象观察下的新探索 基因功能的分析 基因功能研究 目的基因表达调控 细胞水平 动物水平 活性 周期 运动 分化 衰老 凋亡 ………. 模式动物 药物处理 临床样本收集 组织水平 动物组织 稳定细胞系 药物处理 成瘤实验 ………. 免疫组化 qPCR WB ………. 按照论文结构的实验设计 分子准备工作、前期初步实验结果引入 细胞/组织水平现象作用机制切入 作用机制深入 可选： 模式细胞/动物验证 旁通机制 临床样本验证 模式图 Diagram 1 2 3 4 5 6 qPCR WB WB WB RNAi IF FCM IHC Drugs Morphology 基因突变与沉默技术——RNAi 1990年，Jorgensen将色素的基因导入矮牵牛(petunias) ，发现了共抑制现象 (cosuppression)。 1995年，Guo等应用par I基因的反义RNA处理线虫产生了par I 基因功能缺失型或基因敲除型的表型。 1998年，Fire 和 Mello 证实Guo发现的正义RNA或反义RNA诱导基因表达抑制是由微量dsRNA 而引起。提出RNA干涉(RNA interference, RNAi)的概念。 基因突变与沉默技术——RNAi Double-stranded RNA inject C. elegans Neg. control Uninjected Antisense RNA dsRNA sense antisense Nature 1998 391:806-811 Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization Andrew Z. Fire (Stanford University photo) Craig C. Mello (University of Massachusetts Medical School ) 基因突变与沉默技术——RNAi dsRNA ~22nt siRNAs target mRNA secondary siRNAs amplification processing degradation recognition copying + processing spreading 基因突变与沉默技术——RNAi C. elegans Drosophila Arabidopsis amplification processing degradation recognition copying + processing spreading DICER DCR-1 CAF AGO2 RDE-1 AGO1 RISC SID-1 RRF-1 SDE-1/SGS-2 RDE-4 VIG CG1800 Fmr1 基因突变与沉默技术——RNAi C. elegans Drosophila Arabidopsis amplification processing degradation recognition copying + processing spreading DICER DCR-1 CAF AGO2 RDE-1 AGO1 RISC SID-1 RRF-1 SDE-1/SGS-2 RDE-4 VIG CG1800 Fmr1 Initiation Step ATP ATP ADP + ppi ADP + ppi DICER KINASE RdRP Dicer siRNA 5’ 3’ 5’ 3’ RISC Effector