打破DNA物种界限——基因工程.pptVIP

基因重组（genetic recombination） 指一段DNA在细胞内或细胞间，甚至在不同个体或物种之间进行交换，并能在新的位置上复制或转录，乃至翻译。 17.1 基因的天然重组 17.1.1 接合作用(conjugation)  　 　 17.1.4 位点特异重组 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 特点：在供体与受体的特定位点的短同源序列之间，DNA精确切割， 连接。 DNA不丢失、不合成、不交换对等部分（有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，又称整合式重组），需要位点专一性的蛋白质因子参与。 同源重组的Holliday模型 ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体(holliday junction) ③通过分支移动(branch migration)产生异源双链DNA (heteroduplex DNA) ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant) 同源重组的生物学意义 维持种群的遗传多样性； 有助于DNA的损伤修复； 使真核生物产生第一次减数分裂中染色体正确分离到子细胞至关重要的瞬间物理连接。 为基因打靶技术和基因敲除/敲入动物模型的建立奠定了理论基础 基因敲除（gene knockout）：利用同源重组原理，有目的地去除（敲除）实验动物体内某特定基因的技术，以用于观察目的基因的功能 构建同源重组载体 导入胚胎干细胞（embryo stem cells，ES） 通过同源重组敲除原有基因 将敲除成功的ES细胞转入小鼠囊胚（blastocyst）中参与胚胎发育 合理培育，筛选出两个等位基因都被敲除的纯合子小鼠 观察、研究小鼠的表型变化 17.2 基因的人工重组 （2）基因工程的诞生（1972—1976年） 20世纪70年代初，人们发现了限制性核酸内切酶、DNA连接酶和可作为基因工程载体的细菌质粒，使基因工程从理论走向实践。 1972年：Berg 用EcoRⅠ分别酶切猿猴病毒SV40 DNA和λ噬菌体DNA并用连接酶将之连接起来, 第一个重组DNA分子诞生。 1973年：Cohen将酶切的DNA分子与质粒连接，并将其转化入E.coli。 至1976年：相关科学家完成了DNA重组相关的载体与受体细胞的安全性改造。 （3）基因工程技术的成熟（1977-1980’s) 1977年，Itakura等人首次在大肠杆菌中表达了人的生长抑素基因；Ullrich等人克隆并表达了人的胰岛素基因。 1978年，美国Genetech公司开发出重组大肠杆菌合成人胰岛素的生产工艺，揭开了基因工程产业化的序幕。 （4）基因工程技术的腾飞（1980’s-至今) 1982年：转基因小鼠 1983年：转基因植物技术的建立 1990年：基因治疗技术用于临床 1991年：人类基因组计划正式启动 1996年：体细胞隆羊Dolly诞生 17.2.2 基因工程技术中常用的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 末端转移酶 DNA连接酶 多核苷酸激酶 碱性磷酸酶 3）可变酶 所识别的序列中有一个或几个碱基是可变的（通常用N表示），并且识别序列往往超过6个核苷酸。例如： BstpⅠ识别序列为G’GTNACC，其中有 1个可变碱基； BglⅠ识别序列为GCCNNNN’NGGC，其中有5个可变碱基。 4）能识别和切割甲基化序列的酶 例如，DpnⅠ可识别和切割甲基化序列GA’TC（其中的A被甲基化后才能被该酶识别和切割） 5)具有星号活性的酶 17.2.2.2 DNA聚合酶 可将脱氧核糖核酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸聚合。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I，DNA polⅠ） 是由大肠杆菌pol A基因编码的一种单链多肽，具有5′→3′聚合酶活性、5′→3′和3′→5′核酸外切酶活性。DNA polⅠ的5′→3′聚合酶活性和5′→3′核酸外切酶活性协同作用，可催化DNA链发生缺口平移（nick translation）反应，因而常用于DNA探针的标记。 （2）Klenow片段 功能：具有5’ 3’聚合酶的活性以及3’ 5’核酸外切酶的活性。 作用： 补平限制酶消化DNA形成的3’末端