抗体制备术.ppt

抗体制备技术 1、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用 一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激 机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同 抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的 混合物～。 2、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。 抗体制备技术 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的纯化 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的 二、单克隆抗体制备 （一）单克隆抗体制备原理 抗体制备技术 （二）单克隆抗体制备的技术要点 （三）影响杂交瘤技术的因素 （四）单克隆抗体的应用 三、基因工程抗体技术 （一）人源化抗体 （二）小分子抗体 （三）双特异性抗体 （四）抗体库技术 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系 统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最 重要的性质是免疫原性（immunogenicity） 免疫原—天然抗原、人工或合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗 原性抗原和免疫佐剂～ 1、细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清） 2、可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的破碎、提取与纯化～ 1）细胞的破碎（物理法、化学法） 2）提取与纯化： ①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。 ②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境～例50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；8%～12%PEG 6000可沉淀IgG～。 盐析法沉淀抗原的机理 ③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛～ ④层析法—包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，用于抗原等物质的精提～ ⑤电泳——（略） 3）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。 凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理 亲和层析的作用机理 3）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） 分子的质量—电泳、质谱 蛋白的纯度—电泳、高效液相层析 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹 3、半抗原性免疫原的制备 半抗原（hapten）～ 蛋白质等载体（carrier）～ 连接—物理法：即利用电荷和微孔吸附 半抗原 化学法：利用某些功能基团把半 抗原连接到载体分子上 4、免疫佐剂（immunoadjuvant），佐剂 指某些物质，因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体，可增强机体对该抗原物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。 种类—无机、生物性、人工合成、油剂和 纳米颗粒。 用途—抗原表面积增，构型改变；延长抗 原的滞留时间；增强吞噬～ （二）免疫动物 1、免疫动物的选择： ①抗原来源与动物种属的关系（越近越差） ②动物个体的选择（年龄、体重与健康，） ③抗原性质与动物种类 2、免疫的方法： 免疫原的剂量～ 免疫的途径与其间隔时间～ 免疫动物采血～ （对实验成功与否至关重要） （三）免疫血清的纯化 1、特异性抗体的纯化 1）亲和层析 2）吸附 2、IgG类抗体的纯化 1）盐析 2）凝胶过滤 3）离子交换 4）亲和层析 (四)免疫血清的鉴定 1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA） 2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散） 3、纯度的鉴定（SDS-PEAG） 4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合 的牢固程度，以亲和常数表示。 测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非 竞争）结合等。 单抗亲合常数的测定： 单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法： 1）先确定在某