神经生物学常用研究方法.pptVIP

五、神经生物学常用的研究方法 （一）形态学方法 （二）生理药理学方法 （三）生物化学方法 （四）电生理学方法 （五） 分子生物学方法 （六）脑成像（Brain imaging）技术 （一）形态学方法 1、束路追踪法 2、免疫组织化学法 3、原位杂交法 4、受体定位法 束路追踪法 研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域的一个基本问题，其研究方法主要有三： （1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用最广者； （2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法； （3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元质膜荧光追踪法。 （1）轴浆运输追踪法 轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至胞体。不同物质的运输速度不同。 顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。 逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。 常用方法： a 辣根过氧化物酶追踪法 1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技术，即HRP法。 HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。 基本步骤： 将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材作冰冻切片；然后用双氧水（H2O2）及呈色剂四甲基联苯胺（TMD）或二氨基联苯胺（DAB）显示HRP反应产物。 HRP：1.游离HRP： 通过非特异性整体胞饮的方式被摄入 2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元 麦芽凝集素（WGA）-HRP 霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少， 　　　　　　　HRP在胞内降解时间明显延长， 　　　　　　　能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。 注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须具体测试。 呈色剂： 1.二氨基联苯胺(DAB): DAB作为供氢体，HRP在H2O2存在的情况下，能使DAB发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。 2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB) 用途： 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。 b 荧光素追踪法-主要作逆向追踪 　 1977年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经纤维联系的荧光素逆行追踪法。 原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些荧光素发出的荧光颜色各异。 不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢，甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用），fast bule（固蓝）等。 只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。 优点：可靠性，灵敏性，