抗的精制.ppt

抗体的精制 免疫球蛋白的分离纯化的含义 以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。 通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。 因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。 免疫球蛋白的主要成分 γ球蛋白（ IgG ）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的 75 ％，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化 IgG 。 免疫球蛋白的分离纯化的含义 对免疫球蛋白的分离纯化有两方面的含义： 一是从理化性质上提取均质的免疫球蛋白部分，去除杂质蛋白、提高免疫球蛋白的含量。 二是从免疫学角度上提取对某种特定抗原的特异性抗体，这种特异性抗体可以是几类免疫球蛋白 (IgG ， IgM，Ig E) 的混合物。 抗体分离纯化的方法 在血清中的抗体活性是相对稳定的，因此要根据实验的要求，减少不必要的纯化过程，保证抗体的活性和避免抗体绝对量的损失。 中性盐沉淀法是抗体分离和纯化的首选方法，但利用盐析法提取的免疫球蛋白，不能得到纯净的免疫球蛋白。 欲获得较纯净产品，还需要结合其他方法，如凝胶过滤、离子交换、亲和层析、区带电泳等进行进一步分离纯化。 盐析法 (中性盐沉淀法) 盐析的原理 溶液中高浓度的中性盐离子有很强的水化能力，会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失水，发生凝集而沉淀析出。 不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。 免疫球蛋白的盐析条件 许多中性盐都能使蛋白质盐析，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠和磷酸盐等。最常用的为硫酸铵，因它具有溶解度高且受温度影响较小的优点，在室温或冰箱 (4 ℃) 内均可进行。 一般认为在 pH7.0 时， 50 ％硫酸铵饱和度可将所有的免疫球蛋白都沉淀出来。 33 ％饱和度时，大部分 IgG 可沉淀出来。 40 ％饱和度时，沉淀物的得率最高，但含 IgM，IgA 等β球蛋白部分增多。 注意事项 温度：抗体对温度比较敏感，长时间暴露在室温可以使抗体失活，因此提取免疫球蛋白最好在 2-4 ℃条件下进行。 等电点：蛋白质在等电点时的溶解度最低，兔 IgG 的等电点为 pI 8.0 ，操作时应该避开使用等电点附近的缓冲溶液。 蛋白质的浓度：蛋白质的浓度过高时，会出现欲分离的蛋白与其它蛋白质一起共沉的现象因此蛋白质浓度应在 2.5-3% 为宜。浓度过高时应用 PBS 稀释。 离子交换法 离子交换的原理 同等电聚焦电泳一样，离子交换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷相结合，蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。 余下的蛋白质均结合在树脂上，由于其蛋白质表面电荷性质的不同，与树脂的亲和力也各不相同。 利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。 阴阳离子交换 标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链，和不溶性的树脂结合而成。 DEAE 等阴离子交换树脂侧链电荷为正。 CM 等阳离子交换树脂侧链电荷为负。 若蛋白质所带净电荷为负，则需用阴离子交换树脂进行纯化，反之则使用阳离子交换树脂。 免疫球蛋白的离子交换 采用 DEAE-纤维素对抗体进行精制，特别是经过初步纯化后的 Ig 的纯化，效果尤为显著。 IgG 的等电点为 pI=8.0 ， IgM ， IgA 的等电点为 pI 7.0 ， 7.4 ，在 pH 8.0 时 IgG 带正电荷，不能被 DEAE-纤维素吸附而被洗脱下来。 被 DEAE-纤维素吸附的其它球蛋白，可用逐渐增加洗脱液中 离子浓度的方法将其逐一洗脱，或降低 pH 使之洗脱出来。 利用DEAE-cellulose 52离子交换层析分离抗体 DEAE-cellulose 52 chromatography of anti-serum specific to a characteristic protein component of GR 注意事项 进行离子交换层析的最佳溶液 pH 值一般与预分离蛋白质的等电点相差一个单位，这可使蛋白质的净电荷量即可保证将其结合在离子交换树脂上，又不需在洗脱时采用高强度的离子浓度或 pH 值相差悬殊的苛刻洗脱条件。 离子交换树脂再使用前需要再生，阴离子交换树脂以碱酸碱的顺序进行处理，阳离子交换树脂以酸碱酸的顺序进行处理和再生。 装柱时要求粒度均匀，比较致密，柱床表面平整，柱中无裂缝，气泡和沟流的现象，加样蛋白浓度低于 20 毫克/毫升，上样体积小于柱体积的 1/3 ，流速控制在 0.2-0.5 毫升/分钟。 亲和层析法 亲和层析法的原理 亲和层析是利用生物分子间所具