细胞迁移和侵袭实验技术.pptVIP

微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。 滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。 Boyden Chamber 装置 1. 在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3 个孔，其中只加BM的孔为阴性对照； 2. 取对数生长期细胞，0.1%BM 重悬细胞，调整细胞浓度为5×105/ml； 3. 加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3 个孔； 4. 将趋化小室在 37℃，5% CO2 的孵化箱中孵育3h； 5. 在膜的两端加上夹子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3 次后再蘸取一次，晾干； 6. 固定, 染色 7. 取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片； 8. 显微镜观察计数，每孔至少 3 个随机视野，3 个孔的数值取平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别； 9. 趋化指数(Chemotaxis Index)=随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目 1. 膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生； 2. 放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。 3. 枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5 处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。 4. 洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。 Matrigel Invassion Assay Transwell 系统 Transwell 小室 0.4um孔径聚碳 酯膜的扫描电镜 人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃时是液体，在37 ℃ 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 Transwell 电镜图片 1. 无菌条件下 Matrigel 于冰浴融化，用PBS（或DMEM only 培养基）稀释成1mg/ml 浓度，-20°C 冻存备用； 2. 取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，以50ml 的体积铺于Tramwell 小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），37°C 放置lh，使Matrigel 聚合成凝胶（注意：加基质胶时最好将24 孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）； 3. 每孔加入 200ml 1640（或DMEM）培养基使胶重构； 4. 在 Transwell 下室中加入趋化因子或10%FBS 培养基600ml/孔； 5. 在上室孔中准确加入细胞 l×105 个/孔，细胞悬液体积200ml，置于5%CO2 培养箱于37°C 培养24h（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）； 6. 待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞； ①Transwell小室 ②上层培养液 ③细胞 ④基质胶 ⑤下层培养液 ⑥ 细胞培养板 Transwell侵袭实验 示意图 7. 4%中性甲醛固定10 分钟，Giemsa 染色10 分钟，PBS 洗涤3 次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞(200×)； 8. 每张膜中央部分和周围部分各随机取 3 个视野，计数每个视野内的穿过8mm微孔的细胞数。 肿瘤细胞生物学实验室 张宁PI组 体内实验： 皮下移植瘤模型 原位移植瘤模型 肿瘤细胞运动 体外实验 肿瘤细胞运动 常用研究方法 Text in here 侵袭实验 趋化运动 划痕实验 实验原理 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。 划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay） 1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。 2.