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《免疫组化和荧光》课件
制作者:白慧
免疫组化图片
免疫荧光图片
免疫组化与免疫荧光
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素等) 显色来确定组织细胞内抗原,对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法;用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法;这两种方法总称免疫荧光技术,因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合,用于检测或定位各种抗原,也可以与其他蛋白质结合,用于检测或定位抗体,但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用,所以人们习惯称为荧光抗体技术,或称为免疫荧光技术。
实验原理
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记的显色剂 显色来确定组织细胞内抗原;免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
实验步骤
脱蜡水化:
二甲苯Ⅰ 20min
二甲苯Ⅱ 20min
无水乙醇Ⅰ 10min
无水乙醇Ⅱ 10min
95%乙醇 5min
80%乙醇 5min
75%乙醇 5min
50%乙醇 过一遍
蒸馏水 过三遍
高压修复 4min
流水冷却
PBS冲洗 5min×3次
3%H2O2 15 min,37 ℃/(0.5%Triton 5min)
PBS冲洗 5min×3次
10%山羊血清封闭 37℃,50min
一抗 4 ℃ ,过夜
复温 37 ℃ ,1h PBS 冲洗 5 min x3 次 二抗 30 min PBS 冲洗 5 min x3 次DAB显色 <1min /(DAPI 5min)PBS冲洗 (盖片,观察。)
苏木素复染 1min
自来水冲洗
脱水,透明,封片。
石蜡切片在染色过程中出现脱片现象
1)烤片时间不够,或温度不够,可以延长烤片时间和提高烤片温度;2)用含有多聚赖氨酸的玻片;3)有些组织本身就容易掉片,如骨组织等,操作时冲PBS不要直接冲到组织上,冲到组织上方,让它流下冲洗组织;4)用高温修复时,温度骤冷也可能引起。
免疫组化常见问题的处理
标本无染色
① 确认是否忽略了应该加的某种试剂(一抗、二抗、三抗及底物等)。
② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入,是否孵育了足够的时间。
③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体,以及所用的检测系统是否和一抗匹配。
④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤ 检查抗体的有效期和保存条件,尤其是标记了酶或荧光素的抗体,现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价。
⑥ 检查标本的储存条件,最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配,溶液的pH值很重要,与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑧检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性
① 标本的固定方式,不当的固定方式或固定时温度过高,都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
② 不适当的抗原修复方式,由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用,必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法,至于使用哪一种方法,应参照生产厂家的说明,同时结合标本的具体情况而定。
③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围,但是由于使用者的标本来自各种组织,处理过程也不尽相同,所以应参照使用范围,对所使用的一抗进行梯度测试,找出最佳的使用浓度。
④ 切片上遗留了过多的冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤ 孵育时切片是否放置水平,否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应,阳性对照反应良好,而标本弱阳性,则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
产生组织切片非特异性染色
1)抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。
2)一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色,可试用单克隆抗体;3)内源性过氧
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