怎样选择色谱柱.DOC

怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但 是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团 (NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品 中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿 （Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反相色谱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。 反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有 更强的保留。 常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料 聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～ 14均可使用。 相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白 质等样品的分离非常有效。 现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。 三、其他无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的 用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基 键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基 键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由 于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC， 氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。 但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用， 新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应 用PH范围1～14，温度可达100℃ 度，其重要用途与优势尚在进行中。 怎样选择填料粒度 目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、 5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填 充柱的柱效越高；小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度， 但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料 是很有用的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而， 3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更 短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使 用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。 一、如何保证良好的柱性能与柱寿命 ◆ 认证阅读色谱柱使用说明书； ◆ 使用填充良好的色谱柱； ◆ 尽量减少压力波动，避免机械及热冲击； ◆ 使用保护柱及在线过滤器； ◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱； ◆ 充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分； ◆ 用稳定的固定相（C18最稳定）； ◆ 在中等PH值操作（6~8），用有机缓冲溶液； ◆ 色谱柱使用温度最好小于40℃ ◆ 硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0； ◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠； ◆ 流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%； ◆ 过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）。 HPLC固定相及应用范围 名称 别名 功能基团 正相 反相 离子对 应用 Silica -OH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。 SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留最 ????????????????????????????????????????弱，典型用于中等极性和多官能团化合物. Butyl C4 -C4H9 √ √ 分离肽和蛋白质，保