减毒伤寒条沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用分析.docx

华中农业大学2011届硕士学位论文摘 华中农业大学2011届硕士学位论文 摘 要 重组活菌载体疫苗是将外源抗原基因插入活菌载体的染色体或质粒中，激发免 疫系统提呈该外源抗原并产生有效免疫保护，进而达到预防一种或多种疾病的目的。 减毒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhi，＆Typhi)因具有特殊的优点而成为 疫苗研究的热点，被广泛应用于病毒和细菌等疫苗的研制，并且显示出良好的应用 前景。在小鼠模型实验中证明，使用减毒沙门氏菌株携带幽门螺旋杆菌保护性抗原 尿素酶，可以有效将抗原提呈给免疫系统。在减毒伤寒沙门氏菌研究方面已经取得 了相当大的进展，它既可以作为一个更有效的伤寒沙门氏菌疫苗，又可以表达异源 抗原。其中最广泛评估的减毒伤寒沙门菌疫苗候选株是CVD908(砂2 aroC aroD) 以及CVD908一htrA(Ty2 aroC aroD htrA)。 一，利用LRed体内重组系统，以CVD908为出发菌株，敲除其染色体上的asd 基因，以期构建质粒．宿主平衡致死系统，以便稳定地表达外源抗原。用其基因组为 模板，扩增得到asd基因的上下游同源臂，通过酶切连接等方法，将上下游同源臂 连接在打靶载体的卡那霉素抗性基因的两侧，以该载体为模板扩增得到高浓度线性 打靶片段。将含XRed体内重组系统的质粒pKD46电击转化入CVD908，诱导重组 系统表达后，再将打靶片段转化进去，用含卡那霉素平板筛选出阳性转化子。使用 质粒pCP20去除卡纳霉素抗性基因，从而得到CVD908的asd基因敲除株。 使用与敲除asd基因相同的方法，在CVD908(驴aroC aroD asd)基础上敲除 了其毒力基因htrA，对其进行进一步的减毒，并通过PCR和RT-PCR等方法分别 在DNA水平和RNA水平进行了上述基因敲除的验证。 二，在平衡致死系统的基础上，构建表面展示载体，并对展示效果进行评价。 敲除CVD908的asd基因后，菌株出现营养缺陷表型，然后用大肠杆菌(Escherichia coli)的asd基因进行互补。在原始质粒pBAD．Assdsbe的基础上，用大肠杆菌的asd 基因替换质粒上的氯霉素抗性基因，构建平衡致死质粒。在质粒的阿拉伯糖启动子 后面插入表面展示工具及幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶(ureB)基因编码 区序列，从而得到表面展示载体。然后将该载体电击转化入减毒沙门氏菌CVD908 瑚删(Ty2 aroC aroD asd htrA)，得到活菌疫苗株CVD908瑚蒯．LOU。利用UreB 的单抗对疫苗株进行流式细胞计数分析、全菌蛋白和外膜蛋白提取结合免疫印迹分 析以及问接免疫荧光观察分析，都证实UreB蛋白成功展示于菌体表面。 减毒伤寒沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用研究三，对得到的重组菌进行安全性评价。通过细菌侵染小鼠单核巨噬细胞系 减毒伤寒沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用研究 三，对得到的重组菌进行安全性评价。通过细菌侵染小鼠单核巨噬细胞系 RAW264．7和人宫颈癌上皮细胞Hela细胞，进行侵袭力以及24h胞内增殖力实验， 表明CVD908山，叫．LOU较CVD908和野生株Ty2的侵袭力和在胞内生存力显著减 弱。此外又进行了小鼠半数致死量的实验，也表明CVD908砀蒯对小鼠的LDso 较野生株Ty2提高了三个数量级，较出发株CVD908也提高了一个数量级，充分说 明新构建的重组菌CVD908南蒯．LOU安全性较野生株Ty2和出发株CVD908有明 显提高。 四，将表面展示尿素酶B亚单位的活菌疫苗直接口服免疫BalB／C小鼠，进行 动物体内免疫效果的评价。共设四个免疫组，第一组为生理盐水组；第二组为空载 体组(CVD908-htrA—LO)；第三组为尿素酶表面展示组(CVD908-htrA-LOU)；第 四组为尿素酶胞内表达组(CVD908-htrA—U)。两次口服免疫之后，检测血清中尿素 酶特异性IgG抗体水平，结果发现，CVD908-htrA—LOU组激发产生的尿素酶特异 性IgG抗体水平高于CVD908-htrA—U组，尽管后者表达的尿素酶B的表达水平远 远高于CVD908山纾么—LOU组。实验说明，从外源抗原的递送形式而言，活菌载体 表面展示外源抗原，其免疫效果可能更优于同样的活菌载体在胞内表达外源抗原。 关键词：伤寒沙门氏菌，基因敲除，平衡致死系统，尿素酶B，表面展示 II ．华中农业大学201 ．华中农业大学201 1届硕士学位论文 Abstract Live bacteria vector vaccine is a novel kind of vaccine by inserting heterogenous antigen genes