减毒沙门菌介阳导mthsp70hsvtk双基因真核共表达dna疫苗靶向抗肿瘤实验研究.docx

博士学位论文减毒沙门菌介导mtHSP70小SV-tk双基因 博士学位论文 减毒沙门菌介导mtHSP70小SV-tk双基因 真核共表达DNA疫苗靶向抗肿瘤实验研究 博士研究生：曾曙光 导师：张积仁教授章锦才教授 摘要 恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的疾病，据不完全统计，我国每 年死于肿瘤的患者约130万人，全世界每年约700万人被肿瘤夺去了生命。手 术、放疗、化疗仅能治愈45％左右的肿瘤，55％的肿瘤病人因晚期或高度恶性而 无法治愈，肿瘤的预防和治疗已成为全球的医药工作者的重要使命，各国都投 入了大量的人力和物力。肿瘤疫苗作为肿瘤生物治疗的一种重要手段，已成为 抗肿痛研究的热点之一，肿瘤疫苗通过接利，引起细胞免疫和体液免疫反应，激 发人体自身的天然抗肿瘤反应，达到防治肿瘤的目的，它适应了现代肿瘤治疗 中强调的靶向性要求。在众多的肿瘤疫苗策略中，基因疫苗因其独特的优势， 倍受人们的关注。基因疫苗是从基因治疗研究领域发展起来的一利t全新疫苗， 被誉为第三次疫苗革命，成为防治肿瘤的一个重要途径。恶性黑色素瘤可发生 于皮肤、粘膜。发生于口腔粘膜的恶性黑色素瘤是口腔恶性肿瘤中恶性程度最 高的肿瘤，常发生早期广泛转移，约70％转移至区域淋巴结，亦可转移至肺、 肝、骨、脑等器官，远处转移率高达40％，预后极差。因此，开展恶性黑色素 瘤肿瘤基因疫苗研究工作，无疑对于人类抗肿瘤具有十分重大的意义。 本研究综合了目前国内外肿瘤疫苗设计的各自优势，将基因治疗、免疫治 疗结合起来，设计了一利-全新的广义上的基因疫苗，即构建以结核杆菌热休克 蛋白70(mycobacterium tuberculosis heat shock protein70，mtHSP70)和人单纯 疱疹病毒一胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)基因为 中文摘要基础的双基因真核共表达DNA疫苗，利用减毒沙门菌对肿痛的靶向性以之为载 中文摘要 基础的双基因真核共表达DNA疫苗，利用减毒沙门菌对肿痛的靶向性以之为载 体，瘤内注射治疗实体黑色素瘤，其学术思想是以减毒沙门菌将mtHSP70／HSV_TK 基因疫苗靶向传递至肿瘤细胞，予以HSV-TK前体药物更昔洛韦(Gancivol， GCV)，启动HSv_TK对肿瘤细胞的杀伤作用及旁观者杀瘤效应，死亡的肿瘤细胞 与mtHSP70形成mtHSP70肽复合物，该复合物带有全肿瘤细胞抗原的指纹且 mtHSP70为异种，其抗原性优于目前国内外DNA疫苗设计常用的以肿瘤某一特定 抗原所构成的基因疫苗，利于打破目前存在的因DNA疫苗免疫原性不强形成的 免疫耐受，达到抗肿瘤效应。 [目的]： ①构建结核杆菌热休克蛋白7 0(mtHSP70)和自杀基因单纯疱疹病毒一胸 苷激酶(HSV-tk)双基因真核共表达质粒PCMV-mtHSP70一IRES-TK及实验对照组 质粒PCMV—TK—I RES-EGFP和PCMV—mtHSP70—I RES—EGFP。 ②研究重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK与对照组质粒pCMV—TK—IRES—EGFP、 pCMV—mtHSP70一IRES—EGFP、PCMV-IRES-EGFP的体外表达及体外抗小鼠黑色素瘤 细胞B16的效应。 ③构建 SL7207／PCMV—mtHSP70一IRES—TK 重组沙门菌及对照组 SL7207／pCMV—TK—IRES—EGFP、SL7207／pCMV—mtHSP70一IRES—EGFP、SL7207／pCMV— IRES-EGFP重组沙门菌及研究重组沙门菌体外的表达和对B16细胞的侵袭性。 ④确定重组沙门茵痛内注射的剂量、时效性及治疗方案；研究重组沙门菌 SL7207／PCMV—mtHSP70一IRES—TK瘤内注射抗小鼠B16肿瘤效应及机制。 [方法]： ①登陆genbank查询HSV-TK和mtHSP70基因mRNA序列，应用引物设计软 件DNA club分别设计扩增HSV-TK和mtHSP 70基因全长cDNA的特异引物。以 pcDNA3-TK质粒或mtHSP70质粒DNA为模板，分别采用各自的引物，用primeSTAR HS DNA Polymerase进行PCR，获得HSV—TK和mtHSP 70基因cDNA片断，凝胶 回收试剂盒回收得到1 192bp(TK)和1898bp(mtHSP70)的目的基因片断，回收的 博士学位论文DNA进行3‘加A反应，然后连接到T载体pMD 博士学位论文 DNA进行3‘加A反应，然后连接到T载体pMD 18-T上，转化大肠杆菌TGl后 在Amp抗性平板上生长出约200个阳性菌落，每组随机挑选8个克隆接利，到含 500IJ 1LB的2mlEP管中摇菌，用HSv_