放射配基受体结合法-1 (1)..ppt

放射配基受体结合法 Radio Ligand Receptor Binding Assay（RRA） 放射配基结合测定法是可以定量测定配基与受体结合的参数的一种方法。与受体结合的配基可以是激素、神经递质、生长因子等内源性物质和相关药物。 放射配基结合测定法的基本操作是比较简单的，将含有受体的制备物与适当的放射配基一起温孵一段适当的时间，然后对与受体结合的放射活性进行测定。 主要包括三种类型的实验：饱和实验，竞争实验和动力学实验。 我们将依次介绍受体制备，放射配基，检测条件，分离结合与游离放射配基的方法，数据分析等实验内容。 一、受体制备 1.目的：受体制备是在放射配基结合实验前将含有某种受体的组织进行预处理，使之更符合实验的要求。 2.步骤 1）将组织或细胞在低渗缓冲液中匀浆。通常大部分受体在数小时是比较稳定的。但为了保持活性，经常将组织尽快地放置在冰内。纤维组织，例如肺，应该用尼龙网（～50μm）加以过滤。 2）慢速离心（500g）可帮助除去组织中某些不需要的部分(细胞核及大碎片) 。 3）将匀浆在尽可能快的转速下离心5-10min，但不要用超速（即50,000g）。尽管对于很多受体并不需要低温，但离心常规是在4℃下进行。 4）将沉淀用相同缓冲液再度匀浆和离心。最终的组织制备被称为粗微粒部分或膜部分。 5）两步离心的目的是去除任何可溶性干扰物，如内源性的神经递质、鸟嘌呤核苷酸等，它们可能干扰放射配基结合测定。 3.注意事项 1）匀浆缓冲液 匀浆缓冲液的选择通常不是关键，对于大部分受体制备，在中性pH下的任何缓冲液已经足够。对于某些受体推荐在匀浆缓冲液和/或温孵液中加入EDTA，以完全去除各种内源性物质。 质 2）受体制备的贮存 大部分在冷冻下是稳定的，原组织或膜部分均能贮藏在-20℃或-80℃一段时间。某些受体和小块组织（10mg）储存后效果不好，应该用新鲜组织进行测定。 二、放射配基 对于任何受体系统，商业上可提供若干种放射配基，要根据放射配基的特征和要解决的问题加以选择。应考虑的问题包括：放射性同位素的种类（通常是3H或125I），非特异结合的程度，放射配基对受体的选择性和亲和力以及放射配基是激动剂还是拮抗剂等。 1.放射配基的种类 3H放射配基的优点是在化学上较稳定，生物学上与非标记的化合物没有差异，有较长的半衰期（12年），标记配基经常使用数月或更长时间，但它的特异活性较低（30-100Ci/mmol）。 而125I的半衰期短（60天），它的放射配基通常每4-6周购买和准备一次。碘标放射配基的优点是比较高的特异活性（2,200 Ci/mmol），在受体密度低和组织数量少时特别有用。使用碘标配基不需要闪烁液，免除了购买闪烁液的费用和操作步骤，因而方便和价廉。 2.放射配基的亲和力 放射配基与受体亲和力越高越好，因为测定中可以使用较低浓度的放射配基，且非特异结合的水平也较低。另外，亲和力越高，解离速率越慢，操作较方便。 3.放射配基的稀释 有时，为了将一个测定管的特异活性的最大值限制在106计数/min（cpm），可以用非标记配基稀释125I放射配基，从而降低其特异活性。另外，非标记配基应该使用非活性的含碘配基，而不是非碘的配基，因为后者与放射配基在化学上是不同的，可能有不同的药理学特征。 4.放射配基的总结合 通常放射配基的非特异结合越低越好。一个测定中如果50%总结合是特异的，它被认为是合格的；70%是好的，90%是非常好的。 三、温孵条件 1.时间和温度 对于饱和和竞争结合，所用的模型是平衡实验。温孵的时间要足够长，以保证达到平衡（或至少是稳态）。 由于达到稳态的时间依赖放射配基的浓度，在预测温孵时间时，应使用低浓度的放射配基。室温下，使用接近它们Kd的浓度，20-60min可达到稳态。如果在20和60min之间结合是恒定的，那麽可选定温孵时间为30min。 尽管有人认为生理温度（37℃）更好，但实际上在室温下（22℃）测定最为方便。另外，某些测定选在冰中（4℃）进行，因为在这个温度下的数据重复性较好。 2.缓冲液 通常缓冲液pH在生理范围，即pH7和8之间。实验中经常使用Tris作为缓冲液，主要原因是使用方便，因为商品Tris是预先配制好的，不需要调整pH。但Tris