ACEANovoCyte流式细胞仪应用资料.PDF

ACEA NovoCyte 流式细胞仪应用资料 —钙流检测 ■ 概述 钙是机体内最重要的元素之一，是机体各项生理活动不可缺少的离子，参与一切生命的活动过程，比如骨骼形成，肌肉收 测 缩，神经活动，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、 检 流 磷酸二酯酶等）、蛋白水解酶和核酸酶，引起特异的生理生化反应，从而参与细胞代谢、增殖、运动、分化及分泌等功能 钙 活动的调节 (1,2,3)。因此，钙离子 (Ca2+) 测定在生物学及医学研究中有着十分重要的意义。 钙的信使功能是通过调控细胞内游离 Ca2+ 浓度来实现的，因此测定细胞质中的 Ca2+ 浓度十分重要。在多种 Ca2+ 浓度检 测方法中，流式细胞术是一种简单、方便及准确的方法。流式方法使用的钙荧光指示剂种类繁多，常见的有 Quin-2、 Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4 等染料 (4) ，Fluo-3、Fluo-4 以其价格低廉、反应灵敏、可见光激发等优点被广泛应用。 Fluo-3 AM 和 Fluo-4 AM 进入细胞后脱去 AM 酯，与细胞内游离钙结合，488nm 激光激发后产生的荧光信号强度与游 离钙离子浓度成正比。本文使用 ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪，以负载 Fluo-4/AM 后的 Jurkat 细胞为研究对象，测定 了多种外源性刺激物诱导胞浆游离 Ca2+ 浓度的动态变化过程以及激酶抑制剂 Ibrutinib 的钙流抑制作用。 ■ ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪检测钙流： A23187 和 Ionomycin 具有高度的钙离子结合活性，是常用的钙离子载体，在细胞生物学研究中，广泛用于转运钙离子 至细胞质或穿过各种细胞膜 (5,6,7)。使用 ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪，可准确地检测细胞内基础钙流水平及 A23187、 Ionomycin 引起的钙离子浓度变化。如图 1 所示，处于静息状态的 Jurkat 细胞显示平稳的钙离子基线，当加入 A23187、Ionomycin 后，在约 20 秒间隔的起始检测点（图 1A-C）检测到钙离子浓度的瞬时升高，短时持续后逐渐下降， A23187 引起的钙流变化强于 Ionomycin。基于流式检测，以静息状态的钙离子水平为基线，外源刺激诱导的 Ca2+ 浓度 变化的动态过程得以呈现 （图 1D）。 A B C 全国服务热线：400 600 1063 ACEA NovoCyte 流式细胞仪应用资料 —钙流检测 D TM 6 TM 图 1. ACEA NovoCyte 流式细胞仪检测 A23187、Ionomycin 引起的钙离子浓度变化。Jurkat 细胞负载 Fluo-4/AM（Invitrogen，F-14201）后，调整细胞浓度至 1×10 /ml，ACEA NovoCyte 流 式细胞仪上采集静息荧光强度（基线）～ 2min（采样体积 25ul, 采样速度 14ul/min），然后加入 A23187 或 Ionomycin 继续采集 100ul 样本，共采集 125ul 终止。DMSO 为对照，荧光强度代表细胞 内 Ca2+ 浓度高低。A. 加入溶剂 DMSO（Sigma-Aldrich）； B. 加入 2.5μM A23187（Sigma-Aldrich，C7522）；C. 加入 2μg/ml Ionomycin（联科生物，CS0002）；D. 根据基线归零处理后的钙 离子浓度随时间变化曲线（n=3，means ± SEM）。归零处理公