siRNA干预树突状细胞CD40分子表达实验研究.pptVIP

siRNA干预树突状细胞CD40分子表达的实验研究  IBD的发病机制 实验内容 实验结果 讨论 结论 炎症性肠病（Inflammatory bowl disease IBD） IBD是临床常见的肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎（Ulcerative co1itis, UC）和克罗恩病（Crohn,s disease，CD）两大类。 IBD的发病机制可以概括为：1、环境因素；2、遗传因素；3、感染因素；4、免疫耐受。 IBD的治疗：1、常规治疗；2、免疫调节治疗；3、生物调控等。 IBD的发病机制-环境因素 随着社会的发展，全球IBD的发病率呈明显的上升趋势，首先出现在社会经济高度发达的北美、北欧，继而发生在西欧、南欧，最近才是日本、南美。这种变化产生的主要原因大都是环境因素的改变所导致，大量研究表明，许多看似无关的环境因素，诸如吸烟、饮食、药物、地理环境、社会地位、应激、肠道固有菌群、肠粘膜的渗透性和阑尾切除等这些因素在不同程度上与IBD息息相关。 目前公认的假说认为：环境变得越来越清洁，导致儿童期肠道免疫系统接受的外源刺激减弱，由于早年形成的“免疫耐受”不完善，其对肠道抗原刺激发生的免疫反应的自身调节就容易发生障碍，故出现IBD发病率逐渐上升。 IBD的发病机制-遗传因素 家族聚集性和种族差异性：IBD患者一级亲属发病率，明显高于普通人群。 基因：全基因组相关研究(GWAS)已展开，且成为IBD研究的主要手段。 阳性家族史：IBD遗传因素中遗传易感性最为重要，其中阳性家族史是最大的“危险因子” IBD不仅是多基因病，而且也是遗传异质性疾病，患者在一定的环境因素作用下因遗传易感而最终发病。 IBD的发病机制-感染因素 微生物致病性的观点认为IBD(特别是CD)针对自身正常肠道菌群丛的异常免疫反应引起的。其证据为：①CD病变的部位在肠菌浓度最高的末回与结肠。②CD患者粪便转流术使炎症减轻，复原后炎症加重。③各种动物实验要有细菌定植才发生结肠炎症，隔离的肠攀导入细菌可出现早期IBD的表现。④临床上应用抗生素和微生态制剂有一定的临床疗效。 感染与IBD的关系：①肠道感染可以与IBD类似。②感染比IBD更常见。③感染使IBD的病程变得更加复杂。 IBD的发病机制-免疫耐受 免疫调节细胞 。 人类β防御素。 抗原呈递细胞 。 人类白细胞抗原 。 自身抗体因素 。 Chemerin和脂联素 。 IBD的发病机制-免疫耐受 肠道粘膜免疫反应的激活是导致IBD发生、发展和转归过程的直接原因。 免疫调节T细胞，能够产生各种细胞因子，引起并逐步放大粘膜炎症，形成肉眼和镜下的IBD病理及临床表现。经典的“双信号模式”即免疫应答的启动、发展过程中，T细胞的活化需要两个信号。其中第二信号即协同刺激信号，它能够促进T细胞的克隆、细胞因子的分泌及产生效应。CD40/CD40L即第二信号，它属于TNF-TNF受体超家族，通过干预调节CD40/CD40L会有助于IBD的治疗。 IBD的发病机制 Sands概括了近10年IBD发病机制研究的标志性成果：(1)肠道免疫耐受控制着生理性炎症；(2)肠道菌群在IBD发病中起着关键作用；(3)用基因动物模型显示遗传免疫和黏膜屏障的多种紊乱形成IBD的各种亚型；(4)NOD2与CD的发生密切相关，且与天然免疫缺陷有关；(5)新生物技术快速发展，研制出多种新的生物治疗药物；(6)TNFα单抗对CD与UC产生较好疗效。 IBD的干预与治疗 常规治疗：1、支持治疗；2、常规药物治疗；3、手术治疗。 免疫调节治疗。 生物调控：1、免疫调控-抗TNF-α抗体英夫利昔(Infliximab) 、胸腺肽；2、RNAi干预治疗。 阻断CD40途径用于IBD的治疗及展望 。 实验材料与方法 siRNA的设计与合成 pHL-CD40真核表达载体的构建 感受态细胞的制备 重组质粒的提取 免疫磁珠分离DCs 总RNA的提取、cDNA的逆转录 实验材料与方法 磷酸钙法瞬时转染CD40分子 “Western blot、PCR”法检测树突状细胞CD40蛋白质及mRNA的表达 统计学分析 实验研究的目的及意义 阐明CD40在IBD中的作用 确定siRNA的高效性 通过RNAi干预CD40分子的表达治疗IBD的动物实验与临床研究奠定了理论基础。从而为IBD的治疗提供新的途径 实验结果 1(sense）：5＇-GATCCGCTGTGAAGATCAGAAGCTTTCAAGAGA AGCTTCTGATCTTCACAGCTTA-3＇； (antisense)： 5＇- AGCTTAAGCTGTGAAGATCAGAAGCT TCTCTTGAA AGCTTCTGATCT TCACAGCG-3＇; 2(sense)： 5＇-GAT