免疫组织化学技术2010.ppt

1 实验动物的处死 取材 *准确，快速，完整，有代表性 动物标本： -大型动物：快 -小型动物：灌注固定 -手术标本：尽量包括病灶部位/病灶与正常组织交界处/病灶周围正常组织 体外培养的细胞标本： -贴壁生长细胞：爬片 -悬浮生长细胞：离心沉淀涂片 免疫组织化学与免疫细胞化学技术Immunohistochemistry and immunocytochemistry 概述 免疫组织化学，又称免疫细胞化学 带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原-抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。 将血清学—抗原、抗体特异性结合和显微镜示踪法相结合的一种技术方法；将免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 特点及优点 特点: 特异性强,灵敏度高 优点: 将形态学改变与功能和代谢结合起来 保存形态学观察的优点 克服免疫学只能定量和定性不能定位的缺点 发 展 简 史 -抗原的提取与纯化； -制备特异性抗体以及抗体的纯化； -标记抗体； -标本的制备； -免疫细胞化学染色； -观察结果。  抗原(antigen,Ag) 抗原(antigen,Ag)在适当的条件下，能剌激机体的免疫系统发生免疫应答，产生抗原受体（抗体或致敏淋巴细胞）,并能与相应受体在体内或体外特异性结合的物质。 抗原(antigen,Ag) 特性： -免疫原性：能诱导机体产生抗体，由抗原决定簇决定 -反应原性：能特异性地与抗体结合的能力 *抗原决定簇（antigenic determinant): 抗原分子表面的一些特殊的化学活性基团区域，是抗原与抗体特异结合的基本单位，不同种属的动物抗原决定簇完全或部分相同，因此从一种动物提取的某一抗原制备的抗体可在多种动物中进行相同抗原检测。 分类： -蛋白质抗原/多糖抗原/核酸抗原/低分子量物质抗原/氨基酸抗原 抗体（antibody,Ab) 免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig) 为机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞（浆细胞）分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白 包括：IgG\IgA\IgM\IgD\IgE 抗体（antibody,Ab) 结构： -两条重链（H链） -两条轻链（L链） 可变区（variable region,V区）： L链1/2及H链1/4区域内的氨基 酸排列顺序可变。 决定抗体的特异性 是识别并与抗原决定簇结合的部位 恒定区（constant region,C区）：同一种属动物同一型Ig的氨基酸排列顺序相同 这是制备二抗，应用间接法标记信号放大的理论基础 抗体（antibody,Ab) 种类： -多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb):血清抗体 -单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb -基因工程抗体：采用DNA重组技术所生产的抗体 -多克隆抗体（血清抗体）：机体接受抗原的主动或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。 -单克隆抗体: Kohler和Milstein在70年代初发明， 将抗原免疫小鼠后，用小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的人骨髓瘤细胞株在一定的条件下融合，形成具有长期存活并能分泌抗体的杂交瘤细胞，将其分离培养后形成单个瘤细胞的克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔产生的腹水中都含有瘤细胞分泌的Ig,即McAb 具有高特异性和高稳定性 抗体的标记 抗原-抗体复合物（不可见）+标记物=发光或显色（可见） 标记物特点： 1）与抗体形成牢固共价键 2）不影响抗原与抗体的结合 3）放大的效益高 4）原位显示 抗体的标记 标记物的种类： /荧光素*（免疫荧光组织化学技术） /酶*（酶标抗体法,免疫酶组织化学技术） /生物素*（亲合免疫组织化学技术） /铁蛋白/胶体金*（免疫金银标记技术） /葡萄球菌A蛋白 /放射性核素 免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，形成的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。  荧光标记物 异硫氰酸荧光素 （Fluorenscein isothiocyanate,FITC) -性状：分子量为389D黄色结晶粉末 -吸收光谱：4