基因工程3载体(中国药科大学生物工程所有课件).pptVIP

第三节 基因工程载体（vector） 能将目的基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子谓之为基因工程载体 相关概念 有用基因亦称为目的基因或插入物 用于接受重组DNA的扩增载体及其插入物或表达目的基因的受体细胞谓之宿主 插入物的扩增过程称为分子克隆 携带重组DNA分子的宿主为基因工程细胞（菌）或重组细胞（菌） 基因工程载体的必备条件 1、具有有效运载能力 2、携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制 3、在宿主内能控制外源基因表达活动 4、鉴定方便，装卸手续简单 5、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小, 载力要大 6、容易控制、安全可靠、稳定性好 三大类基因工程载体 细菌质粒 病 毒DNA 基因真核表达 植物表达（烟草花叶病毒） 动物表达（腺病毒） 噬菌体DNA 一、细菌质粒 ㈠、质粒的生物学性质 环形双链质粒分子具有三种不同构型 1、共价闭合环形DNA（SCDNA）：两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构; 2、开环DNA（OCDNA）：两条链中只有一条保持完整环形结构，另一条链出现一至数个缺口; 3、线性分子DNA（LDNA）通称L构型：质粒DNA经过适当的核酸内切酶切割后，发生双链断裂而形成; pBR322由三个不同的部分组成 1、来源于pSF2124质粒易位子Tn3的ampr 2、来源于pSC101质粒的tetr 3、来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点 (2)pUC质粒载体的优点 ①具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷贝数(500～700) ②适用于组织化学方法检测重组体 ③具有多克隆位点MCS区段，可以更方便的插入外源基因 二、噬菌体载体和柯斯载体(cosmid) 及单链DNA噬菌体载体(M13) (一)λ噬菌体DNA 1、λ噬菌体的结构和性质 λ噬菌体为双链DNA病毒，宿主为E.Coli。在宿主内有溶菌和溶源两种形式，在溶源方式中，噬菌体感染宿主后其DNA整合到宿主染色体DNA中，伴随宿主染色体复制而复制。 λ噬菌体DNA是有48502bp组成的线性双螺旋分子，分子量3.1×107dal。 迄今已定位的基因至少61个，其中一半参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的“必要基因 ”；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的“非必要基因”。这为其作为基因工程噬菌体载体的基础。 野生型的λ噬菌体DNA两端各具12个核苷酸组成的粘性末端，可用来构建柯斯质粒（cosmid）。 l 噬菌体生物学特性： 生物结构 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l - DNA 2、 λ噬菌体DNA克隆载体 野生型的λDNA不适宜作为克隆载体。因为⑴其分子量较大，⑵常用的限制酶切点较多。如EcoRI切点5个，HindⅢ切点7个，而这些切点大多位于溶菌周期生长所必须基因内，容纳不下比其更大的外源性DNA片段，必须对其进行改造。 改造方法： ①将噬菌体感染到具有EcoR I限制修饰体系的和不具有EcoR I 限制修饰体系的两种寄主细胞中循环生长，使λDNA 的EcoR I 位点发生修饰作用或产生点突变，使其一些EcoR I 位点不能再被EcoR I 切割。最终筛选获得仅有1-2个限制酶位点的λDNA。 ②将λDNA在体外用限制酶消化，再将未切割部分包装并感染E.Coli。如野生型λDNA 上有7个HindⅢ限制位点，从图中可看出，E.Coli位点1 和2之间片段的缺失，可降解去两个HindⅢ位点1和2。 按此上方法，可构建两类λ噬菌体派生载体 ①取代型载体或替换型载体（replacement vector）它具有成对的克隆位点，这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。如λEMBL4和Charon40。 (图5-12) ②插入型载体（insertion vectors） 只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点（也有一些具有两个插入位点）。外源性DNA克隆到插入型的λ载体分子上会使噬菌体的某中生物功能丧失，即所谓插入失活效应。如免疫功能失活的和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。 许多Charon载体带有编码β-半乳糖苷酶基因以及它的操控基因和启动子的lac 5取代