Lipo2000 瞬时转染细胞步骤及相关经验共享.docVIP

Lipo2000 瞬时转染细胞步骤 Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度* Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 RNA Lipofec tamine ?2000 1000-10000 cell/well 96-well 0.3cm2 100ul 2X25ul 0.2ug 0.5ul 5pmol 0.25ul 0.5-2X105 cell/well 24-well 2cm2 500ul 2X50ul 0.8ug 2.0ul 20pmol 1.0ul 1-3X105 cell/well 12-well 4cm2 1ml 2X100ul 1.6ug 4.0ul 40pmol 2.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm2 2ml 2X250ul 4.0ug** 10ul 100pmol 5ul 8-10X105 cell/dish 60mm 20cm2 4ml 2X0.5ml 8.0ug*** 20ul 200pmol 10ul 2-3X106 cell/dish 10cm 60cm2 15ml 2X1.5ml 24ug 60ul 600pmol 30ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。 Opti-MEM? I 减血清培养基是 EMEM 的改良型,其中使用了 HEPES 和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。 常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（CAT），绿色荧光蛋白（GFP），荧光素酶（Lux或Luc）[细胞中本身不表达]以及b- 半乳糖苷酶（b-gal）[在细胞中有内源表达，需设计空白对照]。当报告基因与目的基因共转时，作为内参，评估目的基因的转染效率，并作为分选标志。 像293T细胞，因为半贴壁，换液容易导致细胞飘起来，所以中间不换液。 转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪； 化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术； 生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可