动物科学微生物实儿验指导.doc

动物微生物学实验指导 目 录 实验1　细菌的简单染色和革兰氏染色 实验2　细菌的芽胞、荚膜、鞭毛染色及运动性观察 实验3 微生物细胞形态及菌落特征观察 实验4　培养基制作、灭菌消毒及无菌操作接种技术 实验5　微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数 实验6　微生物细胞大小测定及显微镜直接计数 附录1 常用培养基配方 附录2 常用染色液的配制 附录3 常用试剂和指示剂的配制 参考书目 实验1　细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法； 学习显微镜油镜观察的方法； 二、实验内容 细菌的简单染色； 细菌的革兰氏染色； 三、实验原理 　　简单染色法是一种最基本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色。简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色反应。通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。这是因为两类菌的细胞壁结构和成分的不同，G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经过蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，即紫色。 四、实验材料 1、活材料：培养12～16h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）。 2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油。 五、实验用品 废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、镊子、无菌水、75%乙醇浸泡的消毒棉球、盛有75%乙醇的玻片回收缸、生物显微镜等。 六、实验方法 （一）简单染色 1、涂片：用消毒棉球擦拭双手，用镊子取干净载玻片一块，在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液2～3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2～3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。 2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。★是否还有其它方法？ 3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定，以不烫手为宜。★为什么要进行该步骤？ 4、染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1～2min。 5、水洗：水洗去涂片上的染色液。 6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉。 7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。★怎样操作才能做到既快而又不易损坏玻片地调准焦距？ （二）革兰氏染色 1、涂片：涂片方法与简单染色涂片法相同。★涂片厚薄对结果有影响吗？ 2、晾干：与简单染色法相同。 3、固定：与简单染色法相同。 4、结晶紫初染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色1min，以盖满细菌涂面为宜。之后倾去染色液，用水小心地冲洗。 5、碘液媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min后用水洗去碘液。★此步可否省去？ 6、脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。★为什么要立即水洗？ 7、复染：滴加蕃红复染2～5min，然后用水洗去涂片上的番红染色液。 8、晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 9、镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 10、实验完毕后的处理 ⑴ 将浸过油的镜头按下述方法擦试干净: ①先用擦镜纸将油镜头上的油擦去； ②用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2～3次； ③再用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次，注意擦镜头时向一个方向擦试。 ⑵ 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，并放入盛有75%乙醇溶液的回收缸中。 ⑶ 显微镜复原并做好使用情况登记。 七、作业与思考 （一）、绘图 简单染色后绘出苏云金芽胞杆菌（Bacillus th