克隆基因临表达及基因干扰-修.ppt

（二）miRNA的作用机制 1.起始阶段 2.成熟阶段 3.功能阶段 四、微RNA * （三）siRNA与microRNA的区别 共同点 ① 由22个左右的核苷酸组成 ② 是Dicer酶的产物 ③ 需Argonate家族蛋白的存在 ④ 与RISC形成复合物起干扰、调节作用 ⑤ 可在转录后、翻译水平上干扰靶mRNA 四、微RNA * siRNA与microRNA的不同 siRNA microRNA 外源性 内源性 由长dsRNA经Dicer酶切割得到 由pre-miRNA经Dicer酶切割而来 双链 单链 与靶mRNA完全互补配对 与靶mRNA并不完全互补 AGO2蛋白 AGO1蛋白 降解mRNA而抑制蛋白质翻译 阻止mRNA的翻译而不降解靶 mRNA 抑制转座子活性和病毒感染 还可作为合成蛋白质的模板；表达 具有时序性、保守性和组织特异性 四、微RNA * （四）miRNA的生物学功能 miRNA与生物体的阶段性发育密切相关，可以使特异基因在翻译水平被抑制 四、微RNA * * * * 由于原核生物表达体系缺乏转录后加工系统，不能对目的基因的mRNA转录本进行剪接，所以对外源目的基因有如下要求 * 启动子是DNA上能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 * -35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。 * 哈佛大学的Gilbert实验室建立的，表达能力强。 Tac启动子是个强启动子，trp的-35区和lac的-10区组合而成。 * Ipp（脂蛋白基因启动子）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa * * 一般均为质粒型穿梭载体，都含有在酵母细胞和大肠杆菌中发挥作用的选择性遗传标志和复制子。再插入一些表达结构，包括酵母启动子和一个或多个限制性酶切位点，转录的起始序列和终止序列，编码有用的蛋白结构域的序列。 * 病毒不能复制，但能产生T抗原。大T抗原作为反式因子与SV40 ori结合，使病毒DNA不断复制。 所以COS细胞中只有T抗原，无游离的SV40DNA。COS细胞的特点：能表达SV40的大T抗原。故带有SV40 ori的表达载体在COS细胞中可快速扩增。 * 太长难于进入细胞，太短特异性差，一般选用18个核苷酸左右。 * 化学合成的ASON分子量小，易受核酸酶作用，半衰期短，且ASON是RNA酶的激活剂，为了提高ASON对核酸酶耐受力，避免被细胞内核酸酶降解，因此必须对ASON进行修饰。 * 锤头状核酶通过I,II螺旋与底物RNA结合，形成RNA-RNA杂交链，从而决定了催化反应的底物特异性。在底物RNA中，NUH三联体对于剪切反应也是必需的。特异性切割点在NUH三联体的3’末端。 * 发夹核酶由约50个核苷酸组成。 * 15个脱氧核糖核苷酸构成一个环状催化中心，两侧臂各8个脱氧核糖核苷酸构成酶的底物识别区。 * RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要，在2002年度Science评选的10大科学成就中miRNA名列榜首。 MicroRNA是一种单链21－23nt的小RNA分子，它首先在线虫中发现，随后陆续在果蝇、蛙、鱼、哺乳动物中广泛的被发现。1993年，Lee 等人用经典的定位克隆的方法在线虫 (C. elegans) 中克隆了 lin-4 基因，并通过定点突变发现 lin-4 并不编码蛋白，而是产生一种小 RNA 分子。 MicroRNA 以碱基互补配对的形式与同源mRNA 结合，使目标mRNA 降解或者抑制其翻译，从而实现在转录后水平的对基因表达的调控作用。一种MicroRNA的变化可以引起百种以上的mRNA转录或翻译的变化；同时，一种mRNA也可以接受几种MicroRNA的调控.  * in the last few years has the breadth and diversity of this gene class been uncovered. Thousands of miRNAs act in multiple biological events. * （一）核酶 1.核酶的分类 （1）大分子核酶： 第Ⅰ类内含子、第Ⅱ类内含子、核糖核酸酶P （2）小分子核酶 ： 锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和 neurospora Varkud satellite核酶 二、核酶与脱氧核酶 * 2.核酶的结构 （1）锤头状核酶： 二级结构有三个 螺旋环结构区和 一个催化中心 二、核酶与脱氧核酶 H：除G以外的任一核苷酸 不可逆的自切割反应 * （2）发夹形核酶：