细胞工程动物前组织和细胞的培养.doc

第4节 动物细胞培养 一 动物细胞培养类型 (一)细胞原代培养 1.取材分离 · 取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织 块剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡盐水 BSS） ，冲洗数次。 · Adult  Embryo  Egg 取材分离 Dissection Enzyme Digestion Cell Culture  Finely chopped Primary Explants  Further dissection if necessary Organ Culture 2.组织消化： ·是用酶法将剪碎的组织块分散成 细胞团或单细胞。 ·将剪碎的组织块放人三角烧瓶中， 加人30～50倍体积的0.25％浓度 胰蛋白酶； ·消化：37℃水浴内消化30～60分 钟。 ·过滤：如果大部分细胞已经分散， 终止消化，以不锈钢筛过滤 (100μm）滤除未被消化的组织块。 ·离心：8000rpm/min离心5分钟， 弃上清液,沉淀为细胞。 ·漂洗；Hanks液漂洗两次，每次 2～3分钟，加人营养液 。 3.细胞计数 ·细胞悬液制成后，需要计数 悬液中细胞的浓度，通常以 细胞个数／ml表示。检查方 法如下： ·1）在干净的离心管中加人数滴 细胞悬液，再加人6.4％台盼蓝 （trypan blue）1滴，混匀后静 置2～3分钟； ·2）将计数板（如图）平放在显 微镜台上，在盖片边缘加人l～2 滴染色的细胞悬液，使之完全充 满计数板与盖片间的空间，勿留 气泡，勿使盖片漂浮； ·3）显微镜下记录计数板四角 四个大格中的细胞总数，原 则是: 染蓝的细胞不数（死 细胞），无色的细胞计数 （活细胞），一团细胞按一 个细胞计数。 ·计数时要注意： ·如果细胞团数超过10％，说明 消化过程进行的不充分； ·如果细胞数少于20-50个说明 稀释的不当. (二)传代培养 ·当原代培养成功后，细胞分裂增 殖扩展连片，占满器皿表面。 ·这时需要对其分离重新培养，这 一操作过程称之为传代。 ·有80％～90%或刚刚全部汇合的 细胞，是传代的理想时期。 具体方法如下： 1)吸出培养瓶内旧培养液； 2）加人胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶 底对细胞进行消化； 3）吸出消化液，加人Hanks液，洗去 残留的消化液。 4）加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁， 使细胞脱落制成悬液，计数后记录 其浓度； 5）重新接种培养 Tissue culture flasks · T-flasks · Petri dishes (三)微载体培养 （microcarrier culture) ·1967年，Van Wezel开发了 微载体系统培养贴壁细胞。 微载体是直径为60-250μm 的微珠。 ·最初使用的材料为二乙基氨 基乙基－交联葡聚糖A－50 ·后经改进，用带不同基团的葡 聚糖（dextran）交联成几种 大分子，以利于细胞的贴壁及 生长。 ·目前使用的dextran I、Ⅱ、 Ⅲ三种型号都属于交联葡聚糖 为基质的微载体，每种微载体 所带基团各不相同。 微载体培养细胞的具体步骤 1）选择合适的微载体类型 ●先用少量三种微载体做细胞培 养试验，一定时间内计算细胞 贴壁数量，比较细胞用量、微 载体用量，以此选出适当的微 载体。 （2）浸泡水化及消毒 ·在玻璃容器中加人适量的微载体， 加入磷酸缓冲液（PBS）浸泡3小 时以上，轻轻搅动。 ·搅动速度50～70rpm／min为好。 ·高压蒸汽灭菌， （3）接种 ·根据细胞类型决定接种浓度， 例如，人成纤维细胞的适宜接 种浓度为10 cells／微载体； 非洲绿猴肾细胞（vero）为5 cells／微载体。 ·接种要达到一定浓度，但过高 也不利。 培养中的搅拌转速： ·提供均相培养环境 ·防止微载体集聚 ·促进汽液交换 ·30-120r/min （4）培养观察 · 显微镜直接观察微载体上细胞生长 · 将微载体上的细胞消化下来计数并 计算其浓度: · 取1ml均匀的培养细胞样品，待微载 体沉淀后吸去上清液，加PBS液清洗。 ·加胰蛋白酶37℃消化15min，吸 出消化液后加到培养液中，过滤 分离微载体，离心弃上清夜，保 留细胞沉淀； ·加美蓝染液2ml，血球计数器计 数，计算细胞浓度。 （5）消化 · 传代培养或收获细胞均需使细胞脱 离微载体，通常采用酶消化法。 消化步骤： · 停止搅动，待微载体沉淀后，去净培养液， 用含0.25％EDTA的PBS（pH6.7），按50～ l00ml／g微载体量清洗微载体，弃EDTA-PBs。 · 加人胰蛋白酶一EDTA，37℃搅动消化15min · 加人含10%血清的培养液，终止消化作用。 （6）分离细胞 · 脱离微载体的细胞培养液放人容 器， · 离心沉淀微载体（400r／min，2 分钟）