第四章思电泳技术.ppt

拔梳子 最好在电泳槽中 - + 点 样 - + 电 泳 紫外 ﹢ ﹣ ﹣ ﹢ 电泳结果分析 DNA空间结构 电压 EB 脉冲电场（PFGE） 解决大分子DNA电泳问题 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳： 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 Weintraub．L建立。 1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。 由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。 几个原理及名词： 凝胶原理 SDS作用与变性、非变性 连续与不连续 缓冲液 样品缓冲液 凝胶缓冲液 电泳缓冲液 1xSDS : 50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8) 100 mmol/L DTT 2% SDS 0.1% 溴酚蓝 10% 甘油 Tris 碱 用盐酸一次调PH成功 0.1% SDS 1xTris – 甘氨酸 : 25 mmol/L Tris 250 mmol/L 甘氨酸 (PH8.3) 0.1 % SDS 主要试剂及相关问题： 1、Acr 和 Bis 比例 29：1 ，此时分辨率最佳 ，凝胶成透明；Bis多硬无弹性。 避光室温保存，隔几个月重配。神经毒！！！ 2、SDS 电泳级 10%母液，室温储备。 刺激呼吸系统！！ 3、分离胶、浓缩胶的Tris 缓冲液 PH 6.8 PH 8.8 主要试剂及相关问题： 4、TEMED (四甲基乙二胺) 通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr Bis 聚合。低PH聚合反应受到抑制。 吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！！！ 5、过硫酸铵 提供引发聚合反应的自由基。10% 4℃保存， 每周新配！！ 6、Tris-Gly Buffer 安全！ 凝胶浓度及其分离范围 丙烯酰胺浓度 线性分离范围/kDa 15 12 10 7.5 5.0 10-43 12-60 20-80 36-94 57-212 SDS电泳装置 实验步骤 安装玻璃板 灌注分离胶 加水膜 约30min 后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体 灌注浓缩胶 灌满！ 根据需要插入不同的梳子 30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！ 拔梳子后形成点样孔 孔周围有膜，用针拨开 点样，电泳 - + 蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。 染 色 染色液配制： 0.1% 考马斯亮蓝R250 (先用甲醇充分溶解) 50% 甲醇 10% 冰乙酸 40% 蒸馏水 滤纸过滤 脱色液配制： 10% 甲醇 10% 冰乙酸 80% 蒸馏水 5倍体积染色4小时以上， 脱色摇床，中间更换几次脱色液 硝酸银染色 银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。 优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1ｎｇ)。 缺点:可重复性差 耗费人力 质谱测定有一定的干扰 染色方法 化学显色 光显色 双胺染色 非双胺 染色 是利用氨水同硝酸银进行反应产生银-双胺络合物,将固定后的凝胶浸泡其中,再通过酸化使其显色 是将固定好的凝胶浸泡于酸性的硝酸银中,在硝酸银和蛋白质发生作用后在碱性条件下,用甲醛还原使其显色。 是使用光能还原银离子成金属银。因为光能够在酸性PH还原银,所以一旦凝胶被固定,光显色能使用单一染色溶液,而不像化学染色程序那样通常需要两种溶液。 硝酸银染色 聚丙烯酰胺凝胶的主要优点： ①分辨率高。具有三种效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应；长度仅仅相差0.2％(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开 ②所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶； ③从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。 ④可根据被分离物质的分子大小控制凝胶浓度制成不同孔径的凝胶。 ⑤丙烯酰胺较稳定，无色透明，机械强度好，易观察，可用检测仪直接测定。 凝胶干燥技术 凝胶扫描技术借助薄层扫描仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳条带转换成峰图。 凝胶成像技术通过图像采集和图像分析，利用计算机程序自动识别