定量蛋白组学-个百替生物.pptx

定量蛋白组学; 从基因组学到蛋白质组学  ---人类迈入后基因组时代; 基因组计划的局限： 40～60%的基因编码的蛋白质的功能是未知的。 基因组研究的局限性 常规大规模基因表达检测技术，无法精确反映蛋白质的质与量，组织中mRNA的丰度与蛋白质的丰度并不完全一样。因为基因到蛋白质存在三个层次的调控；蛋白质复杂的后修饰无法从mRNA水平来判断。;蛋白质组学 最早是由Marc Wilkins在1995年提出的，源于蛋白（Protein）与基因组学（Genomics）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。; 对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。可用于筛选和寻找任何因素引起的样本之间的差异表达蛋白，结合生物信息学揭示细胞生理病理功能，同时也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析;定量蛋白质组学技术;双向电泳技术（ Two-dimensional electrophoresis ）; 双向电泳流程; 缺点： 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、 极小蛋白质及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。 敏感性和精确低 ;常见的同位素标记技术;ICAT 试剂有三部分组成，有两种形式，称为“重”和“轻”重型（含8个氘）轻型（不含氘）。;ICAT标记定量技术流程;ICAT法的缺点;同重标签标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ);iTRAQ试剂标记原理; iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连接的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在一级质谱中，不同来源的相同肽段表现为一个峰；在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(114～121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。 ;iTRAQ实验流程;iTRAQ 技术优势;Label-free; ;优点： 无标记定量技术与同位素标记定量技术相比，实验成本低，不需要购买昂贵的同位素标记试剂。 缺点： 不能将不同样品同时进行质谱分析，实验操作比较繁琐。需要更高的数据分析处理方法。;代谢标记法—15N标记法;优点： 高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 灵活性：在培养基中添加同位素标记15N ，操作方便。 缺点： （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。 （2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。 ;SILAC;代谢标记法—SILAC; SILAC相对于iCAT有着更高的精确性，而且不需要复杂的化学过程和纯化步骤保证了样品相似的实验条件。 然而，SILAC不能用于临床的组织和血液标本。 ; 新的生物标记的发现将帮助我们更好地弄???疾病致病机制和预后，用于提高早期诊断的敏感性，找到治疗靶点，弄清药物治疗作用的机制。利用上述定量蛋白组学技术精确定量正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平，进而找出二者的差异，筛选得到与疾病密切相关的差异蛋白，进而确定靶分子，为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据。;Thank you!