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Chapter 19 Homologous and Site-Specific Recombination 1. Please explain why most of engineering E. coli cell strain for protein over-expression has the genetic type of RecA- ? (3 points) 答：大肠杆菌中的RecA蛋白是第一个被发现的DNA链转移蛋白，这类蛋白质在重组中起着核心作用。如果某质粒可能携带可作为大肠杆菌重组系统的底物的DNA重复序列，那就应该考虑换用重组缺陷型菌株的可能性。用携带有recA基因突变的菌株就几乎没有重组的可能性。 2. Please read Invitrogen catalog, and explain how a single Gateway entry plasmid can be applied for multiple different applications. Detail description is expected. (7 points) 答：Gateway这种克隆方法可以使DNA片段通过位点特异的重组在载体之间转移。它是利用λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。λ嗜菌体上的DNA要进入细菌染色体，要在细菌和噬菌体DNA上的特定位点通过重组产生整合和外切作用，这些位点叫做att位点。细菌上的att位点称为attB，噬菌体上的附着位点称为attP，attB和attP都有序列核心序列O，重组就发生在这个序列内。环状的噬菌体DNA必须以线性的形式插入到细菌染色体中，而前噬菌体则结合到两个新的att位点，它们的重组产物分别被称为attL和attR。融合要求attP和attB之间的识别，而外切要求attL和attR之间的识别。 Gateway就是基于这种λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个entry克隆。LR反应是一个attLentry克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 完成构建Gateway?表达克隆仅需两步：1 创建entry克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进entry载体。2 混合包含目的基因的entry克隆和合适的目的载体及GatewayLR Clonase酶，产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。） 用Gateway技术利用了位点特异重组，进行克隆可以去除用多种限制性内切酶克隆的繁琐步骤，可以方便地将目的片段转入多个表达系统（细菌、酵母、昆虫或哺乳动物）。并且克隆效率达95%以上。当基因快速简便地进入目的表达载体时，还能保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。 3. Please read textbook carefully, briefly design a method to distinguish “sequential exchange” or “concerted cutting” during recombination between attP and attB. (5 points) 答：“自杀底物”可以使重组反应停留在中间体的阶段，此时核心序列被切开，而这个切口干扰了重组过程，这样就可以识别出已经起始重组，但还未完成的分子，这些中间体的结构表明单链交换是按前后顺序发生的。 4. Please read textbook carefully and describe differences between type I topoisomerase and type II topoisomerase. 答：DNA拓扑异构酶是可以催化DNA拓扑结构变化的酶。它们暂时解开DNA的一条或两条链，使没有断裂的链穿过缺口，然后重新封住缺口。 = 1 \* ROMAN I型拓扑异构酶在DNA中的一条链上产生一个暂时的缺口， = 2 \* ROMAN II型拓扑异构酶引入一个暂时的双链断裂。 Chapter 20 DNA Repair System 1. Please list RecA’s function in both DNA recombination and DNA repair (5 points) 答：在DNA重组中： RecA具有的处理DNA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反