高效毛细管电泳在蛋白质分提析中应用.ppt

高效毛细管电泳在蛋白质分析中的应用 北京华阳利民仪器有限公司 Beijing huayanglimin Instrument Co.,Ltd 网址：www.cailu .com E-mail:huayanglimin@163.com 一、概述 随着现代生物技术的不断发展 及各种新型蛋白质类生化药物的相继问世．传统的SDS一聚丙烯酰胺电泳及常规的液相色谱技术已远远不能适应大规模药物生产过程分析与产品纯度检验的需要， 而毛细管电泳(HPCE)技术是近年来迅速发展起来的一种新型分离、分析技术。具有高效、快速、简便、微量的优异特点。该技术在生物大分子、无机离子、光学异构体及有机药物分离、分析方面获得了广泛的应用 。 分离原理 毛细管电泳的分离模式 毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会.根据分离原理可分为: 毛细管区带电泳CZE 胶束电动毛细管色谱MEKC 等电聚焦CIEF、等速电泳 CITP、 凝胶电泳CGE 毛细管电色谱CEC 亲和毛细管电泳ACE、免疫毛细管电泳CETA 非水毛细管电泳NACE 芯片电泳等 毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis ，CZE 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流 ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。 是最基本、应用广的分离模式 毛细管等电聚焦电泳（CIEF，isoelectric focusing electrophoresis） 　　 利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带，也同时达到浓缩的作用。 毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 常用于蛋白质、DNA等的分离，是DAN排序的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 是色谱与电泳分离模式的结合 毛细管电泳分离模式选择 根据简单通用性原则,还是以CZE、MEKC为优，分离中性离子时优先考虑MEKC 在分离生物样品时,通常需要根据分离的目的来选择分离方式,若测定样品的尺寸,就须选NGCE或CGE,偶可选CZE或MEKC,要测定样品的等电点,则应选用CIEF,在做亲和作用研究时,应首选ACE. 分离蛋白质和多肽等两性样品时优先考虑CIEF 分离水难溶组分时，优先考虑非水毛细管电泳形式 CE技术的应用 毛细管电泳技术不仅广泛应用于环境保护、生物化学、医学卫生、临床检测、司法、食品卫生、药品检测、农业化学等领，在临床医学等领域的应用也有较多应用 CE在蛋白质分离分析中的应用主要包括： 肽和蛋白的鉴别分析、结构分析、微量制备，以及蛋白的定量测定、纯度检测、非均一性检测、稳定性和动力学研究。 蛋白的鉴别分析通常包括对氨基酸的组成和序列、一些物化常数如分子量和等电点等的测定，以区分和鉴定结构和种类不同的蛋白质 氨基酸与蛋白质分析analysis of amino acids 蛋白质分析 核酸分析及DNA排序 analysis of nucleic acids and sequence of DNA 蛋白质的尺寸分离 蛋白质的尺寸分离或分子量测定，是化学等研究中的重要工作，通常利用超速离心、质谱、凝胶排斥色谱、SDS等方法完成。利用毛细管电泳有较其他方法的优点：１. 只需消耗纳升级的样品；２. 可在短时间内进行重复和自动化的测定 ３. 如果能获得准确的分子量标准，可以比较准确的测定未知蛋白质的分子量；４. 利用紫外等进行柱上检测，可以实现