第四章浩电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术.ppt

回顾;第四章 电泳图谱的图像分析及 蛋白质消化技术 ;蛋白质表达谱;双向电泳分析软件;图像分析的基础： 使用文件扫描仪，但最好使用CCD获得图型。程序首先评估凝胶的“特征”，他是指与凝胶本底相比显现的重要不同。“特征”相当于凝胶上的蛋白质点。可以通过光密度（OD）、大小和体积（整个蛋白质点面积上的OD）来鉴定特征。这些鉴定参数是一块凝胶中或多块凝胶之间特征比较的基础。;第一节 电泳图谱的图像分析;电泳图谱的图像分析简介what can we get from image analysis?;凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立 ;PDQuest 软件简介;PDQuest 软件的使用;PDQuest 软件;PDQuest 软件的使用;一、 图象采集与加工 (editing images);1、扫描：凝胶染色后用扫描仪扫描，透射模式，全彩RGB,分辨率为400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以tiff格式保存。 2、图片加工： 在PDQUEST 2-D分析软件中打开以tiff格式保存的文件可以。（单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“Open”命令，选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击文件名或单击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式保存的文件会自动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析软件自定义的文件格式2D Scan。） 单击工具栏上的control the image display 图标，会出现一个对话框，通过改变此对话框的High 和Low的值以改变明亮度。;;用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要切割的区域，然后在imageadvance cropsave crop settings下保存crop的设定条件并输入保存的名称，其他的图象切割时在imageadvance cropload crop settings中选定先前保存的名称即可 ）;图象采集与加工后就要进行斑点检测，PDQUEST 2-D分析软件通过一个称之为“蛋白质斑点检测向导（spot identification wizard）”的程序来实现的。;单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard”程序。 该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、最大斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序允许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其他一些选项等。 这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象会显示检测到的斑点会用“? 字（Spot Crosshairs）”表示，检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。 在Parameter Set 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质斑点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots窗口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝胶图像需事先打开）。 蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式分别为gel image 和gel spot。;;;由于在进行斑点检测时会错误的识别一些蛋白质斑点，比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质点、将本来是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或者反之。所以在匹配之前最好进行处理，同时将gel scan 、gel image 和gel spot图打开，然后单击edit spot tool，出现一个对话框，此对话框中有增加斑点（make a spot at cursor）, 删除斑点（remove spot at cursor）,合并斑点（combine spot in box）等图标，可根据你的目的而选择其中一个图标进行相应的斑点处理。这些处理只能在gel image图象中处理，但相应的在gel spot图象中会同时得到显示。;;蛋白质斑点检测完了之后，为了比较和分析不同凝胶中蛋白质斑点的改变，PDQUEST 可以建立一个Matchset。 单击matchcreat matchset, 出现一个Matchset的对话框，输入文件名称，保存路径，选择（select）或上载（load）gel spot 图像的文件名，然后单击creat, 出现一对话框，选择其中的一个图象做为参考图象（standard member）, 整个Matchset用单个窗口（signal window）来表示，其中的亚窗口（subwindow）分别用来表示参考图像（用REF来表示）和成员