基因操作的有力工具.PDF

生物物理学报 2010 年10 月 第26 卷 第10 期: 894-901 综述 / Mini Review A CTA BIOPHYSICA S INICA 20 10 Vol.26 No.10: 894-901 指核酸内切酶：基因操作的有力工具 杜忆南, 胡 边, 黄行许 家遗传工程小鼠资源库，南京大学模式动物研究所，南京 210061 本文通过 “绿色通道”投稿 (推荐编委：梁兴杰) 收稿日期：2010-03-26 ；接受日期：2010-04-01 基金项目： 家重点基础研究发展规划资助项目(“973 ”项目)(2009CB918700) 通讯作者：黄行许，电话：(025E-mail ：huangxx@ 摘要：针对动植物进行基因靶向操作的技术 是解析基因功能尧 研究疾病 以及农业经济生产中 一个有用的工具遥 至今 基因靶向操作主要是通过在胚胎干细胞 渊embryonic stem cell ES cell冤 中进行同源重组或者是体细胞核转移的方法进行 但同源重组方法由于需要ES 细胞而被 限制在个别物种 而核转移方法存在核去分化尧 效率低尧 成本高的缺陷遥 近几年 一种基于锌 指核酸内切酶 渊zinc-finger nuclease ZFN 冤 基因靶向修 的新技术被应用于包括植物尧 果蝇尧 爪蟾尧 斑马鱼和大鼠等不同物种的基因操作遥 通过胚胎注射ZFN 的质粒或是mRNA 可以有效地 定靶并迅速地在内源基因上引起可遗传的突变遥 ZFN 介导基因靶向敲除的可行性 使得那些无 法获得ES 细胞和克隆技术支持的物种的基因靶向修 成为可能遥 关键词：锌指核酸内切酶曰 靶向基因操作曰 同源重组曰 核转移曰 模式动物 中图分类号：Q78 0 引 言 锌指核酸内切酶 ZFN 冤 是高效的动物基因组位点特异性修饰酶，它由两部分组成， 一是DNA 结合功能域 DNA-binding domain 冤，由3 4 个识别不同位点、并根据靶位点序 列人为重组的锌指结构域构成，这一部分介导ZFN 与靶基因目的位点的特异性结合；二是 源自Type 域S 类的限制性内切酶Fok 玉，是没有序列特异性的核酸内切酶功能域，这一部 分介导ZFN 对靶位点DNA 的非特异性降解，它需要二聚化来切割DNA 。 将设计好的两个互补的ZFN 分子同时与靶位点结合，当两个互补的ZFN 分子间相距恰 当的距离时 6 8 bp 冤，Fok 玉结构域二聚化并随后切割DNA ，从而可特异性地在基因组特 定位点切断DNA 双链、形成“双链断裂缺口” double strand break，DSB冤 [1 5] 。DSB 可 启动细胞内的DNA 损伤修复机制，一方面细胞通过错配率很高的“非同源重组末端连接” non-homologous end j oining，NHEJ 冤 机制修复DSB，从而在ZFN 靶位点造成随机性的小 片段丢失或是插入，引起基因的靶向敲除；另一方面，由于DSB 可使得同源重组效率大大 提高，在DSB 修复的过程中，如果细胞内同时存在与靶位点同源的DNA 片段，则细胞主 要通过DNA 同源重组 homologo