第七章 核酸分子杂交技术与核酸序列测定.pptVIP

Content of Table 前 言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。 第一节 核酸分子杂交的 基本原理 应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。 一、核酸探针的种类和应用 根据核酸性质和检测目的不同可以分为： （一）基因组DNA探针 （二）cDNA探针 （三）RNA探针 （四）人工合成的寡核苷酸探针 最基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之间在核酸序列上要有高度的特异性 基因组DNA探针 真核生物基因组中存在大量的重复序列和非编码序列，因此选择基因组DNA做探针时，一定要充分考虑实验目的性 利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段特定的DNA序列 cDNA探针 cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产生的。 利用基因克隆的方法可获得cDNA 优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其适用于基因表达的检测。 RNA探针 RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高 早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA杂交，可以反映出基因的转录状态。 人工合成的寡核苷酸探针 利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成寡核苷酸探针 设计寡核苷酸探针的原则 1）序列及长度 根据靶分子的序列而定，长度一般为18-50个核苷酸合适。 2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60% 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发夹”结构 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 5）与非靶标区域的同源性不超过70% 二、探针的标记 探针标记方法: 放射性和非放射性两种 放射性核素： 32P、35S和3H 非放射性标记物： 1）半抗原：生物素、地高辛素 抗原-抗体反应 2）配体：生物素-亲和素反应 3）荧光素 (FITC、罗丹明) 4）化学发光探针 探针标记方法 核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标记，分为化学法和酶法 化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。 酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。 一个理想的标记物应满足： (1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。 常用探针的标记方法 缺口平移法的原理 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。 末端标记法原理 （1）一种是在5`末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 的γ-磷酸转移加到DNA片段5`-OH上。 （2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的[α-32P]dNTP。 生物素光照标记法 光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。 探针的纯化 1.乙醇沉淀法 用无水乙醇沉淀2-3次 2.SG-50柱层析法 3.微柱离心法 Southern印迹法 Southern和Western印迹法 蛋白质免疫印迹法 实验操作 1 细胞裂解物的准备； 2 细胞裂解物的蛋白定量； 3 细胞裂解物的SDS； 4 蛋白质的转移； 5 目的蛋白质的检测。 (四) 斑