M01第一篇第一章 病毒.pptVIP

四、病毒的培养 (一) 病毒样品的采集与制备 病毒存在于动、植物病灶组织、体液、分泌物、粪便、下水污泥、活性污泥、污水、河水、湖水、海水等处。 固体病毒样品采得后，加液体培养基制成悬液，以10000 r/min 离心10 min，去除杂质，取其上清液备用。 液体病毒样品 直接以10000 r/min离心10 min，去杂质，取其上清液备用。 空气病毒样品采用真空泵抽取至长有宿主菌的平板上，或是将长有宿主菌的平板打开盖，在空气中暴露 30～60 min以收集。 若样品中病毒浓度大则要适当稀释，若样品中的病毒浓度小则要浓缩。 四、病毒的培养 (二)动物病毒的培养 1.动物病毒的空斑试验 (1)单层细胞的制备和培养：用无菌小刀将动物组织切成0.5～1mm3的小块，用平衡盐溶液(Hanks或 Earles)洗涤数次，加体积分数5％胰酶消化10～15min(有的消化时间长至30min，甚至十几小时)，将细胞间的“间质蛋白”水解，使细胞分散，将胰酶冲洗掉，吹散细胞并计数。加入含牛血清的生长液，分装，保持37℃温度，培养2～3d即长成单层细胞，以备培养病毒用。还可经传代后再培养病毒。 (2) 动物病毒的接种与观察 ① 将病毒悬液置于单层细胞的表面，经适当时间孵育，使病毒最大限度地吸附在宿主细胞上。 ② 将软琼脂或羧甲基纤维素注入铺在单层细胞表面，经过一定时间培养，结果在单层细胞上呈现出空斑。 ③ 以出现的空斑数判断病毒数ηPFU。 (二) 噬菌体的分离培养 双层琼脂法培养： 1.制底层平板 在实验的前一天在灭菌的培养皿内倒入10 mL适合某种宿主菌生长的琼脂培养基，待凝固成平板后置于一定温度的恒温箱内烘干平板上的水分。 2.制上层平板 取2～3滴宿主菌(每1 mL约含108个细菌)于软琼脂培养基(融化并冷至45℃)中，再加入0.1 mL噬菌体样品，摇匀后全部倒入，使铺满整个琼脂平板上，凝固后，于一定温度的恒温箱中倒置培养；经培养一定时间后，取出计数。 第五节 病毒对物理、化学因素、抗生素的抵抗力及在污水处理过程中的去除效果 一、病毒对物理因素的抵抗力 （一）温度 1.高温 病毒大多数在55～65℃范围内不到1h被灭活。脊髓灰质炎病毒中有抗热变异株，可在75℃温度下生存。并且抗热的病毒在衣壳破裂后有感染性的RNA释放出来。一般情况下，高温使病毒的核酸和蛋白质衣壳受损伤，高温对病毒蛋白质的灭活比对病毒核酸的灭活要快。蛋白质的变性作用阻碍了病毒吸附到宿主细胞上，削弱了病毒的感染力。 但是，环境中的蛋白质和金属阳离子(如Mg2＋)可保护病毒免受热的破坏，黏土、矿物和土壤也有保护病毒免受热的破坏作用。 2.低温 低温不灭活病毒，在-75℃保存病毒。天花病毒在鸡胚膜中冰冻15年仍存活，经冷冻真空干燥后可保存数月至数年。   （二）光及其他辐射 1.紫外辐射 紫外辐射具有灭活病毒的作用。其灭活的部位是病毒的核酸，使核酸中的嘧啶环受到影响，形成胸腺嘧啶二聚体。尿嘧啶残基的水合作用也会损伤病毒。见图1-10。紫外辐射的致死作用会随培养基的浊度和颜色的增加而降低。 2.可见光 在天然水体和氧化塘中，日光对肠道病毒有灭活作用，在低浊度1.7 NTU)的水中，当平均光强2.7J/(cm2·min)，平均温度26℃时，80％的脊髓灰质炎1型病毒在3h内被灭活。在氧气和染料存在的条件下，大多数肠道病毒对可见光很敏感被杀死，这叫“光灭活作用”。染料附着在核酸上，催化光氧化过程，引起病毒灭活。 3.离子辐射 X 射线、γ射线也有灭活病毒的作用。 图1-10 紫外辐射对核酸的损伤 A.胸腺嘧啶二聚体结构 B. 尿嘧啶水合作用  (三) 干燥 1.在医院的环境中 干燥是控制环境中病毒的重要因素。如在相对湿度(RH)7％时，腺病毒2型和脊髓灰质炎2型病毒至少存活8周，柯萨奇病毒B3存活2周。当RH在35％时，肠病毒可在衣物的表面存活达20周。 2.大环境中 气溶胶、灰尘、土壤及干污泥中的病毒,在水分含量低于10％时，病毒会迅速灭活。在污泥中，当固体含量大于65％时，病毒量减低。病毒被灭活是由于病毒RNA释放出来而随后的裂解所致。 气溶胶化的病毒，如无被膜的细小核糖核酸病毒类和腺病毒类在相对湿度较高时存活最好。而有被膜的病毒如黏病毒类、副黏液病毒类、森林Semliki 病毒等则在相对湿度较低时存活最好。 二、病毒对化学因素的抵抗力 1.体内灭活的化学物质有