分子生物学课件7--DNA重组技术.pptVIP

基因工程：外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。 基因工程的理论依据： 遗传物质——DNA DNA双螺旋结构模型 操纵子学说 基因的表达与突变（中心法则） 基因工程的工具酶的发现 基因工程的基本程序： 分 — 切 — 接 — 转 — 筛基因工程技术的特点： 1. 可在体外人工的, 有目的的, 根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复； 2. 方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 多莉羊 英国爱丁堡罗斯林研究所 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、发酵工程 克隆（clone） 无性繁殖 名词：从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。 动词： 基因克隆 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。 基因克隆示意图 自然界的基因转移和重组 基因重组(genetic recombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制, 转录和翻译 自然界的基因转移和重组是无目的的 基因工程有目的 结合作用 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）。 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。 基因工程 工具酶 载体 重组DNA技术的基本过程 基因的克隆和分离 文库的构建 克隆基因的表达 工具酶 一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖 限制性核酸内切酶(restriction enzyme) 识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 命名： EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序) 识别和切割位点 回文结构 4～6 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端 粘性末端与平头末端 修饰酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的活性 5′至3′的聚合活性 5′→ 3′方向 核酸 外切酶活性 5′→ 3′外切酶活性 3′→ 5′外切酶活性 pol Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 大片段 （Klenow片段）：聚合活性、 3′→ 5′外切活性 常用的工具酶 核酸外切酶活性 3′→5′外切酶活性 5′→3′外切酶活性 载体 vector DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和表达 克隆载体、表达载体 原核载体：质粒(pBR322, pUC…） 噬菌体（λ，M13）等 真核载体：动物病毒载体pLXSN等 载体的基本要求： 1.复制单位; 2. 克隆位点(多个单克隆位点); 3. 筛选标记; 4. 分子量尽可能小; 5. 外源DNA插入后不影响载体本身的复制. 没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造. 质粒 plasmid  λ-噬菌体 λ- phage M13  柯斯质粒 cosmid 质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 ——理想的质粒 拷贝数多; 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lac Z)