蛋白质和氨基酸测定.pptVIP

与茚三酮相比：灵敏度相当，且不受NH4+的影响，但不能与Pro反应，可以和Cys的-SH反应，为此，TNBS前，碱性条件下30℃保温数小时，使-SH都氧化成-S-S-后，再测定。 碱性条件下测定的优势是可以用420nm，在可见光范围内，劣势是每种氨基酸的消光系数不同；酸性条件下的优势是每种氨基酸的消光系数同，但需紫外光。 * 蛋白质和氨基酸测定 思考题 １、硫酸、硫酸铜及硫酸钾在消化中起了什么作用？样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？ 2、甲醛法测定氨基酸的原理？ 3、考马斯亮蓝比色法及Lowry比色法测定蛋白质的原理？ 4、茚三酮比色法测定氨基酸的原理及影响因素？ * 蛋白质含量低大头娃娃 蛋白质含量“高”，肾结石 为何测定蛋白质 1、重要的营养物质 婴幼儿配方乳粉Ⅰ:蛋白质≥18%； （GB10765-1997） 婴幼儿配方乳粉Ⅱ、Ⅲ :蛋白质12-18%； （GB10766-1997） * 椰子汁中蛋白加热沉淀 黄酒贮藏中的沉淀大部分为蛋白质 2、影响食品色、香、味及结构 面筋蛋白：面包粉≥33%；蛋糕粉: ≤22%馒头粉25%-30%（ SB/T-93 ） * 第一节 蛋白质的定量测定 定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。 一、凯氏定氮法 奶粉中测得氮含量为2.12%,蛋白质含氮为16%，奶粉中蛋白质含量? 换算系数通常6.25，牛乳及制品为6.38，大豆及制品为5.71等。 * 脱水性：将H、O按2：1比例脱去，剩下C、N 氧化性： 2H2SO4 + C ＝2SO2↑+ 2H2O + CO2↑ 3SO2+2N +3H2O=3SO3 ↑ +2NH3↑ H2SO4 酸性： H2SO4 +2NH3= (NH4)2SO4 丹麦化学家Johan Kjeldahl（1883）发明的，当时只用H2SO4分解试样，需长时间，后来Gunning改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升从而加快分解速度。后来…… * 1、原理 样品与硫酸、催化剂加热消化，蛋白质分解，其中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵，加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后以盐酸滴定。 硫酸钾之目的：提高沸点，加快有机物分解； 硫酸铜之目的：催化剂、消化终点的指示剂（CuSO4蓝绿色如果没消化完全，则为Cu2SO4）、蒸馏前加入碱量合适否的指示剂。2CuSO4+C=Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+SO2+2H2O * 2、过程——消化、蒸馏、吸收、滴定 （1）消化 小火至泡沫消失→加大火力至透明无黑粒，摇动使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30min→绿色 * （2）蒸馏与吸收 常量凯氏定氮 微量凯氏定氮 改良微量凯氏定氮 * A、蒸馏完全判断 经验时间：常量凯氏定氮约30min，微量定氮装置中是指示剂变色后，再蒸馏10min，提离液面，再蒸馏1min； 萘氏试剂遇氨气呈红棕色。 配制：3.5gKI+1.3gHgCl2 溶于70ml水，加4mol/lNaOH 30ml。 B、吸收 用2%或4%硼酸作为吸收液，应注意接收管浸没在吸收液中。 C、常量、半微量、微量概念 * 常量：＞0.1g，＞10mL； 半微量：0.01g-0.1g ， 1mL-10mL ； 微量：0.1mg-10mg，0.01mL-1mL。 eg:称样0.85g,消化后，直接蒸馏，取出消化液，定容至100mL，取其中的10mL蒸馏…… 常量凯氏定氮 改良微量凯氏定氮 * （3）滴定 (NH4)2B4O7+HCl+H20→NH4Cl+H3BO3 用盐酸标准溶液滴定吸收有氨气的硼酸液。 指示剂：0.1%甲基红+0.1%溴甲酚绿 终点判定 2%硼酸溶液，蓝绿色→灰色 4%硼酸溶液，蓝绿色→酒红色 主要与混合指示剂的变色范围有关： pH＜4.0红色 =5.1灰色 ＞6.2绿色 * 样品中被恶意添加硫酸铵、氯化铵，？ 样品中被恶意添加硝酸铵，？ 样品中被恶意添加碳酸铵，？ 样品中被恶意添加尿素、三聚氰胺，？ N含量66.67% * 策略一：甲醛法测定样品消化前铵盐含量 4NH4++ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O