第二章 第七节 微生物限度检查.pptVIP

一 微生物限度检查对环境和设备的要求 1.环境洁净度10000级以下的局部洁净度在100级的单向流空气区域,无菌操作,防止再污染. 2.供试品包装完好,未开启,阴凉干燥处放置. 3.表面活性剂,中和剂或灭菌剂应证明有效性及对微生物生长和存活无影响. 4.细菌培养温度30~35℃;真菌培养温度23~28℃;控制菌培养温度35~37℃. 5.检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。 二 微生物限度检查的基本步骤 (1）抽验量和检验量 常用供试液的制备方法 1。一般供试品的供试液制备 3 具抑菌活性的供试品 当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下： ①培养基稀释法： 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml 供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 三 细菌 真菌 酵母菌的计数 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。 （一）计数方法的验证 当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌，真菌，及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌，真菌及酵母菌数的测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌，真菌及酵母菌计数所规定的方法及相关要求进行。对各试验菌的回收率应逐一验证。 1 验证试验用菌种 菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代）。应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕 白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕 黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕 2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48 小时。 3 验证方法 （1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和50～100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 （二 ）检查法 按已验证的计数方法进行供试品的细菌,真菌及酵母菌菌数的测定.取验证的方法制备的均匀供试液,用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10，1：100，1：1000等稀释级。 1 平皿计数法  （1） 在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释级供试液各1ml至每个直径90mm的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各1ml至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注2～3个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。 （2 ）阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。 2 薄膜过滤法 （1 ）薄膜过滤法主要起到富集微生物、分离去除样品中对微生物生长产生干扰的因素的作用，可以有效提高检查结果的灵敏度和可靠性，是近年来微生物检查领域中日益广泛应用的一种技术手段。 （2 ）薄膜过滤法采用的滤膜孔径应不大于0.45um。滤膜直径一般为50mm，为便于计数，以及减轻供试液堵塞滤膜的情况，在便于操作的前