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副猪嗜血杆菌的病原学检测RESEARCH ON DETECTION OF HAEMOPHILUS PARASUIS 汇报内容 研究背景 研究的主要内容 结果与分析 小结 研究背景 随着我国规模化养猪业的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，造成重大经济损失。 由于需要从病原学角度证实，而我国缺乏用于副猪嗜血杆菌检测的标准血清及诊断方法，因此我们开展相关研究。 解决方法 1 分离鉴定副猪嗜血杆菌。 进行副猪嗜血杆菌的流行病学调查，从而生产相对于主要流行优势菌株的疫苗。 建立副猪嗜血杆菌的快速诊断方法，为控制该病提供前提。 研究的主要内容 1．病原的分离鉴定。 2．标准血清、分型方法的建立和临床应用。 3．转铁结合蛋白PCR诊断方法的建立和临床应用。 第一章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定 病料采集 　　　　剖检样品的病变表现为胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。我们采集病变的肺脏和扁桃体作为病原分离的样本。 病原菌分离方法 　　　 在无菌操作条件下从疑似病猪的肺脏和扁桃体等病料中取样, 在巧克力琼脂平板或TSA培养基上划线接种, 37 ℃培养48 h后挑取单个菌落,转接相同的培养基再进行纯培养。 涂片镜检 挑取上述纯培养菌落涂片,革兰氏染色后观察细菌形态。  分离鉴定两株副猪嗜血杆菌 分离菌株溶血性测定 两株副猪嗜血的血清型鉴定 用本实验室制备的Hps标准阳性血清对本地分离菌株进行血清型鉴定。 (1) 琼脂扩散方法：湖北分离株血清型为5型，湖南分离株则未能检测出血清型。 (2) 间接血凝抑制方法: 检测出湖北分离株的血清型为5型，湖南分离株的血清型为13型。 分析与讨论 对于Hps 分离较为困难, 需要在典型新鲜病料的采集、适宜的培养条件及分离者的判断经验上更为关注, 才能提高其临床分离率。 这两株副猪嗜血杆菌分离株对麦芽糖、葡萄糖、蜜三糖、木糖、阿拉伯糖、D-核糖、接触酶、氧化酶、甘露醇、山梨糖、乳糖、尿素酶反应表现为一致,但对蔗糖、半乳糖、果糖、和H2S、山梨醇、甘露糖的生化反应不一致。 第二章 副猪嗜血杆菌的血清学分型方 法的建立和临床应用 检测抗原的制备 结果分析 免疫后抗体产生的规律(Hps-5、Hps-1为例) 抗血清效价检测 抗血清的在两种检测方法中的特异性 抗血清的保存期测定 分离株的鉴定 将保存的96株副猪嗜血杆菌制作成相应的热稳定分型抗原，利用本试验制备标准阳性血清，采用琼脂扩散试验进行分型。 分析与讨论 标准副猪嗜血杆菌在家兔内产生抗体的强弱。 本研究中探索了琼脂扩散方法和玻片凝集方法在副猪嗜血杆菌血清分型中的应用。 三种分型抗原在琼脂扩散分型方法的应用。 第三章 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白 PCR诊断方法的建立和临床应用 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白tbpB保守序列的筛选 标准副猪嗜血杆菌（15个血清型）tbpB的检测 该方法灵敏性、特异性检测 人工感染病料和临床病料的检测 讨论分析 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白tbpB保守序列的选用 将tpbB-PCR检测的目的片段在NCBI网站上经过BLAST比对后发现，该基因5’端225bp到514bp（288个nt）片段在大部分Hps中保守． 不同血清型副猪嗜血杆菌tbpB的检测 灵敏性试验 特异性试验 人工感染病样的检测 临床病料中检测的结果 对送检的18份临床病料进行tpbB-PCR检测 　　　7、 14号样品中出现288bp的目的带。 临床病料的16S rRNA-PCR检测结果 在相应的16S rRNA检测过程中，7、14号样品中出现821bp的目的带 分析与讨论 为了评估tbpB-PCR方法的特异性，12种血清型的APP和多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌一些其他的菌株被用于实验，结果11个血清型的APP和一些其它菌株的检测结果均为阴性，这有力证明了我们所确定的tbpB的序列在Hps中的保守性。 实验比较了2种不同的模板制作方法，一种是碾磨病料，直接提取病菌的全基因组作为模板。第二种是将小块病料在TSB液体中过夜培养，煮菌，离心后提取上清作为模版。结果显示第二种方法制做模板所检测的效果明显优于第一种方法。因此我们认为该方法灵敏性较高，模板制作方法简单，更加适用于临床病料的检测。 根据文献介绍，Hps多定居在鼻腔和扁桃体，所以我们在采集病料过程中也应该注意这一点，这也会影响到我们检测该菌的敏感度。 小 结 从病料中分离鉴定了2株副猪嗜血杆菌。 制备了15个血清型的副猪嗜血杆菌标准阳性