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花药和花粉培养 第五章 花药和花粉培养 本章主要内容： 花粉和花药培养的概念和应用 花粉小孢子发育途径 花粉和花药培养方法 单倍体植株鉴定和染色体加倍 第一节 花粉和花药培养的概念和应用 花粉和花药培养的概念 花药和花粉培养的历史 花粉和花药培养的应用 异同点： 相同点：二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。 不同点： 花药培养属器官培养，花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒 花粉培养属细胞培养: 花粉培养没有药壁组织干扰； 可计数小孢子产胚率； 可观察雄核发育的全过程； 单倍体产量高。 但技术更复杂，比花药培养难度大。 二、植物花药/花粉培养历史 Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养 Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养） Chu（1973）小麦花粉培养 （早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低） 80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功Konzak (1999) 。 通过花药培养育成的甜椒新品种：海花三号 三、花药和花粉培养的应用 1)诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期； 2) 提高目标基因型的选择效率 花粉单倍体是纯合配子体，从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是(1/2)n，而从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的概率为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍。 3)诱变育种中的作用 2、物种进化研究 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。 3、遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。 4、构建连锁图谱 双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。 5、用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影响 第二节 花粉孢子体发育途径 概念：花粉孢子体发育途径（雄核发育途径） 花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径，也叫雄核发育途径 一、花粉发育的阶段 二、雄核发育途径 1、雄核发育与P花粉的形成 P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉） 2、雄核发育与饥饿处理 饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。  1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。 2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。 胚状体发育途径 通过胚状体途径再生形成小植株 胚状体发育途径 愈伤组织发育途径 第三节 花粉和花药培养方法 一、花药培养 二、花粉培养 三、白化苗现象 四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素 一、花药培养 1、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。 2、消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。 3、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。 二、花粉培养 (一)花粉的分离与纯化 1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。 1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来； 2）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。 4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子 (二)花粉培养方式 1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。